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circRNA的定義和特征
環(huán)狀RNA (circRNA)是一類新的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，大量存在于真核轉(zhuǎn)錄組中。大部分的環(huán)狀RNA是由外顯子序列構(gòu)成，在不同的物種中具有保守性，同時(shí)存在組織及不同發(fā)育階段的表達(dá)特異性。由于環(huán)狀RNA對核酸酶不敏感，所以比線性RNA更為穩(wěn)定，這使得環(huán)狀RNA在作為新型臨床診斷標(biāo)記物的開發(fā)應(yīng)用上具有明顯優(yōu)勢。
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circRNA在哺乳動物細(xì)胞中的形成
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circRNA特征
• circRNA沒有“尾巴”
常規(guī)存在于線性RNA分子中的3’和5’端在環(huán)狀RNA中被連接形成了閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖1）。而經(jīng)典的RNA檢測方法只能分離具有PolyA“尾巴”結(jié)構(gòu)的RNA分子，所以環(huán)轉(zhuǎn)RNA在以往的研究中通常被忽略了。
• circRNA不翻譯
雖然很多circRNA是由蛋白編碼基因產(chǎn)生，但是還沒有結(jié)果顯示circRNA在細(xì)胞中編碼蛋白。環(huán)狀RNA也因此被定義為一類新型非編碼RNA。
• circRNA的細(xì)胞定位和穩(wěn)定性
大部分環(huán)狀RNA在細(xì)胞漿中富集，其豐度有時(shí)甚至比相應(yīng)的線性mRNA高10余倍，這可能是由于環(huán)狀RNA比線性RNA更穩(wěn)定造成的。核酸酶往往通過識別線性RNA分子末端發(fā)揮作用，環(huán)狀RNA是一個(gè)閉合結(jié)構(gòu)，因此對核酸酶具有高耐受性。
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國家自然科學(xué)基金為何如此“鐘愛”circRNA
近年來circRNA研究如火如荼，國內(nèi)研究也緊抓熱點(diǎn)，這一點(diǎn)從國家自然科學(xué)基金的傾向性可見一斑：從2016年的約80項(xiàng)circRNA相關(guān)項(xiàng)目，到2017年的176項(xiàng)（包括2項(xiàng)杰出青年基金，1項(xiàng)優(yōu)秀青年基金，2項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目，94項(xiàng)面上項(xiàng)目，62項(xiàng)青年基金項(xiàng)目，15項(xiàng)地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目） ，再到2018年的200多項(xiàng)（包括87項(xiàng)面上項(xiàng)目，11項(xiàng)地區(qū)基金項(xiàng)目，65項(xiàng)青年基金項(xiàng)目等）。
其中，腫瘤學(xué)項(xiàng)目獲批最多，如中科院生物物理所的“環(huán)形RNA CircDcun1d4調(diào)控肝癌干細(xì)胞自我更新的作用及分子機(jī)制研究”，中山大學(xué)的“環(huán)狀RNA介導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移研究”等等。
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circRNA的發(fā)展路程
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1971年，研究者發(fā)現(xiàn)類病毒（Viroids）能侵染植株并導(dǎo)致死亡，與病毒不同的是，類病毒沒有蛋白質(zhì)外殼包被，基因組是單鏈、閉合、RNA分子。
1993年，在小鼠精子決定基因Sry中發(fā)現(xiàn)環(huán)狀轉(zhuǎn)錄。
2006年，在果蠅中發(fā)現(xiàn)來自于Muscleblind的未知環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本。
2012年，Salzman通過RNA-Seq方法首次報(bào)道了~80個(gè)環(huán)狀RNA。至此借助于高通量測序技術(shù)，circRNA才真正為自己正名。大量的circRNA分子被相繼發(fā)現(xiàn)。
2013年，Nature雜志兩篇重要的研究論文揭示出一些環(huán)狀RNA充當(dāng)分子“海綿”，結(jié)合并封閉了microRNAs。自此，環(huán)狀RNA在科學(xué)界受到了前所未有的關(guān)注。
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1979年，洛克菲勒大學(xué)的Hsu和Coca-Prados在電子顯微鏡下觀察到的真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中觀測到環(huán)狀RNA的存在。
2014年，circRNA逐漸成為了RNA領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，Arraystar公司全球首推第一款商業(yè)化circRNA芯片。
2015年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所研究員李世訪與中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)吳清發(fā)教授合作，在世界上首次發(fā)現(xiàn)蘋果中存在具有核酶活性的環(huán)狀RNA。
2017年，德國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA與大腦功能存在關(guān)聯(lián)。
2018年，越來越多的研究證實(shí)環(huán)狀RNA與癌癥密切相關(guān)，有望成為癌癥生物標(biāo)記物
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“過去，人們大多把circRNA看作是奇怪的現(xiàn)象。隨著二代測序的發(fā)展，最近四五年人們發(fā)現(xiàn)這些分子其實(shí)是
非常普遍的。這一全新領(lǐng)域在很短時(shí)間內(nèi)得到了飛速發(fā)展。”
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——希伯來大學(xué)的Sebastian Kadener |
circRNA的功能與作用
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circRNA競爭性吸附miRNA
circRNA與相應(yīng)microRNA結(jié)合，像“海綿”吸附miRNA，使miRNA無法與靶基因結(jié)合，進(jìn)而共同參與調(diào)控靶基因的表達(dá)。這一作用機(jī)制被稱為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）機(jī)制。通過與疾病關(guān)聯(lián)的miRNA相互作用， circRNA在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，這一點(diǎn)是目前circRNA最主要的研究思路。
circRNAs調(diào)控可變剪切或轉(zhuǎn)錄過程
circRNA通過堿基互補(bǔ)配對直接調(diào)控其他RNA水平，circRNA可能參與蛋白翻譯。一直被認(rèn)為是非編碼RNA的circRNA也能編碼多肽，并通過其行使功能。circMbl是由剪切因子MBL的第二個(gè)外顯子環(huán)化而來，競爭mRNA的線性剪切。CircMbl的側(cè)翼外顯子和自身序列包含MBL特異性結(jié)合的位點(diǎn)。MBL的表達(dá)水平受到circMbl的調(diào)控影響。研究表明，MBL通過調(diào)整circRNA形成和線性可變剪切之間的平衡來影響可變剪切過程。formin（Fmn）基因可以通過backsplicing形成circRNA。該circRNA包含翻譯起始位點(diǎn)作為“mRNA trap”，形成一個(gè)非編碼線性轉(zhuǎn)錄本而減少Fmn蛋白的表達(dá)。
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circRNA調(diào)節(jié)RNA結(jié)合蛋白（RBP）
circRNA能與蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)活性、募集蛋白質(zhì)復(fù)合體的組分或調(diào)控蛋白質(zhì)的活性, circRNA可能參與蛋白翻譯。一直被認(rèn)為是非編碼RNA的circRNA也能編碼多肽，并通過其行使功能。
circRNA與大腦功能
circRNA可能對大腦功能很重要。比如說，一種名為CDR1的哺乳動物circRNA在神經(jīng)元中含量很高，神經(jīng)元基因經(jīng)常產(chǎn)生circRNA轉(zhuǎn)錄本，在衰老過程中circRNA會在果蠅大腦中累積。不過人們沒能全面了解哺乳動物大腦中的circRNA。
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“理解環(huán)狀RNA在大腦或其他器官中的功能，將是生物學(xué)的重大進(jìn)步。”
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——斯坦福大學(xué)的分子生物學(xué)教授Julia Salzman |
circRNA的研究思路與方法
以中科院生物物理研究所的范祖森教授課題組2018年發(fā)表在國際知名學(xué)術(shù)期刊Immunity（IF=22.845）的文章為例：
（芯片實(shí)驗(yàn)由康成生物提供技術(shù)服務(wù)）
研究人員利用Arraystar Mouse CircRNA Array研究了小鼠骨髓細(xì)胞（BM）中分離的長期造血干細(xì)胞（LT-HSCs）和多能干細(xì)胞（MPPs）的circRNAs表達(dá)譜，篩選出一個(gè)在LT-HSCs細(xì)胞核高表達(dá)的circRNA cia-cGAS，可以與DNA敏感的cGAMP合酶cGAS相互結(jié)合并抑制其酶活性，阻礙cGAS結(jié)合基因組DNA，從而不能激活I(lǐng)型干擾素（IFN）的表達(dá)，維持LT-HSCs的靜息狀態(tài)。該研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)cia-cGAS是cGAS介導(dǎo)的自身免疫相關(guān)的有效抑制劑，為有效防治自身免疫性疾病與血液系統(tǒng)惡性腫瘤提供了新思路和潛在藥物研發(fā)靶標(biāo)。研究成果2018年發(fā)表在國際知名學(xué)術(shù)期刊Immunity（IF=22.845）。
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一、研究背景
長期造血干細(xì)胞（LT-HSCs）是潛能最高的干細(xì)胞系，具有最高的更新和分化能力，可以為短期造血干細(xì)胞、多能干細(xì)胞（MPPs）等提供了持續(xù)性細(xì)胞補(bǔ)給。大多數(shù)時(shí)候，LT-HSCs處于休眠的靜息狀態(tài)，其干性的維持受多種因素的影響。
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二、研究思路+技術(shù)路線
Step 1 篩選
研究人員通過Arraystar Mouse CircRNA芯片分析了小鼠骨髓中分離的長期造血干細(xì)胞LT-HSC與多能干細(xì)胞MPPs的circRNAs表達(dá)譜，篩選出156種差異表達(dá)的circRNAs。qPCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片一致。
Step 2 鑒定
shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)，只有D430042O09Rik基因轉(zhuǎn)錄的circRNA cia-cGAS可以影響LT-HSCc的亞群分布。
Step 3 表達(dá)分析
隨后研究人員通過qPCR、Northern blot、核質(zhì)分離及原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cia-cGAS在LT-HSCs的細(xì)胞核內(nèi)高度表達(dá)。
Step 4 功能分析
接下來作者對cia-cGAS的相關(guān)功能進(jìn)行了研究。作者通過刪除下游的反向互補(bǔ)序列特異性敲除cia-cGAS，F(xiàn)ACS分析表明敲除后LSK細(xì)胞明顯增多，LT-HSC明顯減少，并且敲除后LT-HSCs的BrdU染色陽性率明顯高于對照組，表明敲除后LT-HSCs處于活躍的增殖階段。脈沖標(biāo)記也顯示敲除后LT-HSCs細(xì)胞靜息狀態(tài)的比例顯著降低。然后作者通過對敲除小鼠的mRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)I型IFN表達(dá)顯著上調(diào)，qPCR和ELISA也驗(yàn)證了這一結(jié)果。以上實(shí)驗(yàn)表明cia-cGAS可以通過I型IFN信號傳導(dǎo)調(diào)控LT-HSCs的靜息狀態(tài)。
Step 5 分子機(jī)制分析
最后作者對cia-cGAS發(fā)揮功能的分子機(jī)制進(jìn)行了探討。RNA pull down、RIP、免疫熒光、EMSA和FISH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cia-cGAS可以和cGAS蛋白相互作用。接下來作者通過酶活測定、ChIP、HPLC、熒光素酶和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)表明cia-cGAS可以阻礙cGAS與LT-HSCs自身DNA結(jié)合，從而抑制其酶活性，不能激活I(lǐng)型IFN的表達(dá)。然后作者用CRISPR/Cas9突變cGAS基因，qPCR、ELISA、BrdU標(biāo)記等實(shí)驗(yàn)表明，突變后I型IFN表達(dá)被抑制，LT-HSCs細(xì)胞數(shù)量正常且更多的維持在靜息狀態(tài)。這些均表明了cia-cGAS作用的機(jī)制就是通過結(jié)合cGAS抑制其表達(dá)，從而不能激活I(lǐng)型IFN的表達(dá)，維持LT-HSC的靜息狀態(tài)。動物實(shí)驗(yàn)顯示，在cia-cGAS敲除的小鼠中，poly（I:C）與HSV病毒的刺激均可導(dǎo)致大量I型干擾素的產(chǎn)生，從而誘發(fā)自身免疫性疾病，而cia-cGAS過表達(dá)則可以消除這些，表明cia-cGAS是cGAS介導(dǎo)的自身免疫疾病的有效抑制劑。
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第二個(gè)例子：看曹雪濤院士如何做circRNA研究！ |
曹雪濤院士課題組和第二軍醫(yī)大學(xué)于益藝教授課題組合作在肝臟領(lǐng)域頂尖雜志Hepatology（IF=13.246）發(fā)表了題為“Circular RNA MTO1 acts as the sponge of miR-9 to suppress hepatocellular carcinoma progression”的文章，研究失調(diào)的circRNA和肝癌中的功能。
（芯片實(shí)驗(yàn)由康成生物提供技術(shù)服務(wù)） |
一、研究背景
肝細(xì)胞癌（HCC）是一種高死亡率的原發(fā)性肝癌，是最常見的惡性腫瘤之一。一些內(nèi)源性的非編碼RNA如circRNA在發(fā)育、細(xì)胞功能和特定的病理學(xué)應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，使得對失調(diào)的非編碼RNA在癌癥生物學(xué)中的作用的研究越來越引起人們重視。
二、研究思路+技術(shù)路線
Step 1 篩選——從臨床樣本出發(fā)，通過高通量芯片篩選結(jié)合qPCR驗(yàn)證得到目標(biāo)circRNA。
作者選擇了7例HCC組織及其相應(yīng)的正常組織對照，用高通量circRNA microArray進(jìn)行分析，篩選出肝細(xì)胞癌中20個(gè)差異最為顯著的CircRNA做聚類分析——其中包括10個(gè)circRNA顯著上調(diào)，10個(gè)circRNA顯著下調(diào)，qPCR驗(yàn)證了這20個(gè)circRNA與芯片結(jié)果一致。
Step 2 鑒定——鑒別并確認(rèn)目標(biāo)circRNA，并在更大量臨床樣本中確認(rèn)普遍性
作者對來源于21個(gè)病人的HCC樣本中對上述20個(gè)circRNAs的表達(dá)情況進(jìn)行了驗(yàn)證，確認(rèn)circMTO1 （has_circRNA_0007874/has_circRNA_104135）在HCC組織中顯著下調(diào)。繼續(xù)放大樣本量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于正常肝組織，circMTO1在87.4%（228/261）的肝癌組織中表達(dá)顯著下降。用過組織原位雜交（ISH）等方法表明，HCC組織中circMTO1表達(dá)越低，HCC病人的預(yù)后越差，circMTO1與HCC病人的惡性程度相關(guān)。
盡管還有幾個(gè)候選circRNA（circARID1B, circFAM13B, 和circFARP2）在HCC樣本中也有下調(diào)，但是沉默這些circRNAs對HCC細(xì)胞的生長沒有明顯的影響，而沉默circMTO1會明顯促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖。
Step 3 表達(dá)分析
用組織原位雜交（ISH）等方法分析116例帶有生存數(shù)據(jù)的樣本，結(jié)果表明，HCC組織中circMTO1表達(dá)越低，HCC病人的預(yù)后越差，circMTO1與HCC病人的惡性程度相關(guān)。
Step 4 功能分析
過表達(dá)或敲除實(shí)驗(yàn)表明circMTO1會影響肝細(xì)胞癌的增殖，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)果。
Step 5 分子機(jī)制分析——以circRNA的ceRNA機(jī)制為基礎(chǔ)，預(yù)測并篩選出circRNA結(jié)合的miRNA，檢測其下游靶基因，對其分子機(jī)制進(jìn)行深入研究
通過Miranda預(yù)測circMTO1能結(jié)合99個(gè)microRNA。為了確定到底是哪些miRNAs可以與circMTO1結(jié)合，作者用circMTO1特異性的探針對這99個(gè)miRNAs進(jìn)行了RIP（RNA in vivo precipitation）篩選。作者著重分析了早前報(bào)道的20個(gè)可以在HCC中起作用的miRNAs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-9明顯富集，從而確定circRNA可以和miR-9結(jié)合。
通過FISH實(shí)驗(yàn)表明，circMTO1確實(shí)可以與miR-9在胞質(zhì)中共定位，表明circMTO1確實(shí)可以與miR-9在胞質(zhì)中結(jié)合。且HCC樣本中的共定位明顯少于正常組織。
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后繼研究
研究人員在HCC細(xì)胞中沉默circMTO1，以研究circMTO1對HCC進(jìn)展的影響以及與miR-9的相互作用。作者檢測了8個(gè)細(xì)胞系中circMTO1和miR-9的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SK-Hep1相比中circMTO1表達(dá)最低，miR-9表達(dá)最高，QGY-7701細(xì)胞中兩種RNA的表達(dá)都適中， HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中的circMTO1表達(dá)較高，而miR-9的表達(dá)較低。
因此，研究人員選擇在HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中沉默circMTO1。作者在circMTO1的接口處設(shè)計(jì)了siRNA，在HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)入siRNA后通過qPCR進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明沉默circMTO1明顯促進(jìn)了細(xì)胞增殖，增強(qiáng)了細(xì)胞的侵襲，并且減少了凋亡。另外在HepG2和SMMC-7721細(xì)胞中過表達(dá)miR-9與沉默circMTO1效果相似。
研究人員還構(gòu)建了circMTO1的過表達(dá)系統(tǒng)，在SK-Hep1和QGY-7701細(xì)胞中過表達(dá)circMTO1，明顯促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。
研究人員還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)和沉默circMTO1都不會影響miR-9的表達(dá)水平，這說明circMTO1是通過“海綿吸附”來抑制miR-9的功能的。
為了進(jìn)一步證實(shí)circMTO1是否是通過“海綿”吸附miR-9來發(fā)揮抗腫瘤的作用的，研究人員檢測了腫瘤抑制基因p21的表達(dá)情況（p21也是miR-9的靶基因），結(jié)果表明，無論是沉默circMTO1還是轉(zhuǎn)入miR-9的mimics，在HCC細(xì)胞中都可以明顯減少p21的mRNA和蛋白水平。過表達(dá)circMTO1則可以增加p21的mRNA和蛋白水平。這說明circMTO1可能是通過防止p21被miR-9下調(diào)來行使其抗腫瘤作用的。
接下來，研究人員實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)加入miR-9的抑制劑時(shí)，p21的mRNA和蛋白水平都不再被下調(diào)了，circMTO1沉默也不再促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡了。這可以說明，加入miR-9的抑制劑可以阻斷沉默circMTO1的作用。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
最后作者又建立了一個(gè)HCC的裸鼠模型（SMMC-LTNM），通過尾靜脈注射circMTO1的siRNAs，兩周之后發(fā)現(xiàn)，腫瘤生長加速了，血清中AFP的水平明顯增加。尾靜脈注射siRNAs48h后SMMC-LTNM的腫瘤組織中circMTO1和p21的表達(dá)水平明顯減少。另外，內(nèi)源性敲低circMTO1也會抑制p21及其下游CDK2的表達(dá)，而細(xì)胞侵襲和增殖的marker MMP2和PCNA則上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明circMTO1可以在體內(nèi)抑制HCC的進(jìn)展。
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Tips——研究circRNA的思路（來源：網(wǎng)絡(luò)）
一、篩選circRNAs。常用方法：高通量芯片篩選，RNA-seq等
二、驗(yàn)證與鑒定circRNA+表達(dá)分析。常用方法：Q-PCR，F(xiàn)ISH，Northern等
circRNA的RT-PCR驗(yàn)證特別之處。
常規(guī)PCR引物只針對目的片段的上下游進(jìn)行設(shè)計(jì)，而circRNA引物可分以下兩種方式設(shè)計(jì)：
1）外顯子環(huán)化circRNA，需要特異性針對剪切位點(diǎn)處（backsplice junction site)來設(shè)計(jì)primer；
2）內(nèi)含子環(huán)化circRNA，可跨剪切位點(diǎn)設(shè)計(jì)，也可圍繞內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)引物。另外，circRNA引物設(shè)計(jì)建議還需要滿足擴(kuò)增產(chǎn)物長度不超過100bp；且內(nèi)參基因不能選用線性mRNA，可采用外參彌補(bǔ)。
circRNA表達(dá)的組織特異性驗(yàn)證：用原位雜交技術(shù)（Situ Hybridization）進(jìn)行驗(yàn)證。設(shè)計(jì)雜交探針時(shí)要跨backsplice junction位點(diǎn)，而后可很清楚的看到circRNA在哪些組織中表達(dá)很高，作為組織特性判斷的依據(jù)。細(xì)胞定位是決定調(diào)控機(jī)制研究方向的關(guān)鍵。
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三、circRNA功能分析常用方法：正向驗(yàn)證——circRNA過表達(dá)；反向驗(yàn)證——circRNA沉默/敲除
正向驗(yàn)證——circRNA過表達(dá)
目前比較公認(rèn)的成環(huán)機(jī)制為circRNA側(cè)翼序列的堿基互補(bǔ)配對，稱之為Alu結(jié)構(gòu)。基于此，可用PCR擴(kuò)增含側(cè)翼Alu序列的目標(biāo)DNA序列，而后依據(jù)相應(yīng)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行酶切，連接至pEGFP-C1載體中。將連接載體轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞樣本，定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。最后用divergent primer驗(yàn)證circRNA過表達(dá)倍數(shù)。
過表達(dá)策略：1.擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域包含circRNA側(cè)翼Alu序列或內(nèi)部堿基互補(bǔ)序列，側(cè)翼上下游1kb處過表達(dá)效率更佳；2.目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增基于基因組DNA為模版。
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反向驗(yàn)證——circRNA沉默
沉默circRNA，可用siRNA沉默，即針對circRNA 的backsplice junction位點(diǎn)前后序列設(shè)計(jì)siRNA；而對于內(nèi)含子環(huán)化circRNA，還可針對內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)siRNA。最后利用Divergent primer驗(yàn)證circRNA敲除倍數(shù)。此外，每個(gè)siRNA設(shè)計(jì)相應(yīng)的對照（backsplice junction位點(diǎn)一端互補(bǔ)配對，另一端錯(cuò)配)。 |
四、circRNA機(jī)制研究
目前針對circRNA的功能機(jī)制研究不多，潛在的調(diào)控基因表達(dá)和蛋白合成方式有：
1）circRNA可以作為“sponge”海綿吸miRNA，調(diào)節(jié)靶基因；
2) circRNA能與蛋白質(zhì)/RNA結(jié)合,募集蛋白質(zhì)復(fù)合體的組分或調(diào)控基因的表達(dá)；
3）circRNA通過堿基互補(bǔ)配對直接調(diào)控其他RNA水平。
一般來說，ceRNA調(diào)控機(jī)制是circRNA作用機(jī)制研究的首選，因而很多文章優(yōu)先從ceRNA的角度去解釋其作用機(jī)理。而circRNA作為miRNA的“sponge”有兩個(gè)基本前提：
1）circRNA和mRNA有共同的miRNA結(jié)合位點(diǎn)。
2）circRNA影響其競爭結(jié)合對象mRNA的表達(dá)。
首先用RNA-FISH確認(rèn)circRNA在細(xì)胞中的定位。細(xì)胞定位是決定調(diào)控機(jī)制研究方向的關(guān)鍵。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控尤其是ceRNA調(diào)控，一般認(rèn)為在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，如果該circRNA主要定位于細(xì)胞質(zhì)，那么是有可能成為ceRNA分子的。
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尋找靶定circRNA的miRNA及miRNA靶定的mRNA。
1）利用生物信息學(xué)對其進(jìn)行預(yù)測，即通過miRcode/starBase篩選circRNA潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)（MRE），同時(shí)通過miRTarBase預(yù)測miRNA的靶基因。而后用通過熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)及免疫共沉淀（RIP）進(jìn)行驗(yàn)證circRNA和mRNA之間的表達(dá)呈正相關(guān)性。
2）也可直接通過circRNA+mRNA組合芯片高通量篩選，分析差異表達(dá)circRNA和mRNA之間的表達(dá)相關(guān)性分析，尋找與circRNA關(guān)系密切的mRNAs |
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最后，驗(yàn)證circRNA對miRNA及其下游靶基因的表達(dá)影響。這部分可通過過表達(dá)和沉默circRNA中檢測mRNA的變化，過表達(dá)和沉默mRNA來檢測circRNA的變化以及circRNA和mRNA表達(dá)相關(guān)性分析加以驗(yàn)證。
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其它案例
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這篇題為“CircNT5E acts as a sponge of microRNA-422a to promote glioblastoma tumorigenesis ”的文章，對GBM相關(guān)的非編碼RNA進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn) circNT5E能夠作為miRNA-422a的海綿吸附體，抑制其活性，進(jìn)而影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的腫瘤發(fā)生。
篩選分子
作者收集３對臨床GBM樣本，進(jìn)行高通量檢測，對其中差異表達(dá)的RNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，挑選了548個(gè)表達(dá)上調(diào)的circRNA/lncRNA進(jìn)行進(jìn)一步的研究。通過TargetScan預(yù)測，確定38個(gè)高潛在的miRNA-442a海綿吸附體，并利用生物素標(biāo)記的miRNA pulldown實(shí)驗(yàn)，鎖定了目標(biāo)circRNA—hsa_circ_0077232 (circNT5E)。
circNT5E介導(dǎo)的GBM表型研究
在確定目標(biāo)后，就要研究一下circNT5E是不是會對GBM表型有影響，研究者使用FISH檢測了正常，WHO I，WHO II，WHO III和WHO IV膠質(zhì)瘤組織中的circNT5E。結(jié)果顯示，隨著臨床分類的增加，circNT5E的表達(dá)水平顯著增加（下圖a-b）。
在配對的GBM腫瘤組織（n = 18）中進(jìn)行的qRT-PCR測定顯示腫瘤組織中circNT5E表達(dá)顯著高于正常組織（下圖c）。這些結(jié)果表明circNT5E在膠質(zhì)瘤中起著致癌基因的作用，從而促使我們研究circNT5E的功能。而后檢查細(xì)胞活力，增殖，凋亡，侵襲和遷移能力。
體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，circNT5E不僅對GBM細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲有一定的影響，還能有效促進(jìn)體內(nèi)GBM腫瘤的形成。
circNT5E如何行使功能
確認(rèn)過表型，是遇見對的circRNA～
研究者要對circNT5E在GBM中如何行使其功能進(jìn)行研究。綜合考慮生物素標(biāo)記的miRNA pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)果，circNT5E的編碼能力以及circNT5E大量穩(wěn)定存在于GBM細(xì)胞質(zhì)中的事實(shí)，研究者選擇從ceRNA的角度來進(jìn)行深入分析。
研究結(jié)果表明，circNT5E可直接結(jié)合miRNA-422a，作為其海綿吸附體影響下游靶基因的表達(dá)。
進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，circNT5E能夠通過與miRNA-422a的結(jié)合，解除miRNA-422對其下游靶基因的抑制作用，進(jìn)而影響GBM細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲。
研究者利用高通量的方法篩選了GBM相關(guān)的非編碼RNA，circNT5E可通過海綿狀膠質(zhì)母細(xì)胞瘤抑制因子miRNA發(fā)揮額外的調(diào)節(jié)功能。 這些結(jié)果為開發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的新型治療方法提供了意見。
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第二例：PRMT5 Circular RNA Promotes Metastasis of Urothelial Carcinoma of the Bladder through Sponging miR-30c to Induce Epithelial–Mesenchymal Transition. Clinical Cancer Research. 2018circPRMT5通過ceRNA機(jī)制誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)膀胱尿路上皮癌轉(zhuǎn)移
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中山大學(xué)腫瘤防治中心附屬腫瘤醫(yī)院謝丹課題組利用Arraystar circRNA 芯片研究發(fā)現(xiàn)在circPRMT5與膀胱尿路上皮癌（UCB）的晚期病人與生存較差的病人中存在正相關(guān)。而后功能研究發(fā)現(xiàn)circPRMT5可以通過吸附miR-30c促進(jìn)UCB細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。臨床研究發(fā)現(xiàn)circPRMT5/miR-30c/SNAIL1/E-cadherin通路對于UCB增殖極其重要，而且circPRMT5在UCB臨床病人的血清和外泌體中都上調(diào)表達(dá)。該研究成果發(fā)表在學(xué)術(shù)期刊Clinical Cancer Research（IF: 9.619）。
（芯片實(shí)驗(yàn)由康成生物提供技術(shù)服務(wù)） |
研究背景：
膀胱尿路上皮癌具有較高的發(fā)病率，是世界上最常見的惡性腫瘤之一。迄今為止，還沒有針對UCB轉(zhuǎn)移特效藥。因此深入研究UCB的腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，可以為UCB臨床患者提供更有效的抗腫瘤治療方式。
circRNA是一類共價(jià)閉合的環(huán)狀RNA，可以通過外顯子跳躍和反向連接形成環(huán)狀RNA。在不同的生理?xiàng)l件下，環(huán)狀RNA的表達(dá)具有極強(qiáng)的動態(tài)性。近來研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可以通過吸附miRNA參與到腫瘤的發(fā)生過程，因此circRNA也是一類有前景的腫瘤診斷和治療的分子標(biāo)志物。但circRNA是如何參與腫瘤的EMT過程，其分子機(jī)制仍不為人知。
外泌體是一類從細(xì)胞釋放到胞外微環(huán)境的直徑在30-100nm之間的具有膜結(jié)構(gòu)的盤狀小囊泡，其內(nèi)包裹著miRNA、mRNA和蛋白，行駛著胞間信息交流的功能。最近，已有文章證實(shí)腫瘤細(xì)胞可以釋放包含著circRNA的外泌體到血清中，但其病理學(xué)功能仍未知。UCB病人的血液和尿液中外泌體的數(shù)量有明顯的上升，研究UCB病人的外泌體包含的circRNA及其分子功能，具有重要的臨床意義。 |
研究思路：
文章著重于研究circPRMT5在UCB臨床病人中的功能和機(jī)制研究 |
Step 1 篩選+鑒別+表達(dá)分析
作者運(yùn)用Arraystar circRNA芯片檢測UCB的腫瘤組織和正常組織中circRNA的表達(dá)量，通過差異倍數(shù)、p值、FDR值篩選之后，發(fā)現(xiàn)circPRMT5的表達(dá)量在腫瘤組織中上調(diào)最明顯。隨后，作者收集119對UCB腫瘤組織和配對的正常膀胱組織，通過qPCR驗(yàn)證了circPRMT5在UCB腫瘤組織中普遍上調(diào)。 |
Step 2 功能分析+分子機(jī)制
為了研究circPRMT5在UCB組織中的功能，作者構(gòu)建了覆蓋circPRMT5反向剪切位點(diǎn)的shRNA，結(jié)果顯示敲低circPRMT5之后，明顯抑制UCB細(xì)胞的遷移和侵襲能力。另一方面，過表達(dá)circPRMT5可以增強(qiáng)UCB細(xì)胞的遷移和侵襲能力。動物模型顯示，通過小鼠尾靜脈注射穩(wěn)定敲低circPRMT5的T24細(xì)胞系（UCB細(xì)胞系），小鼠的肺部轉(zhuǎn)移灶顯著減少；注射過表達(dá)circPRMT5的細(xì)胞系，肺部轉(zhuǎn)移灶明顯增加。
機(jī)制研究顯示，通過AGO2 RIP實(shí)驗(yàn)，circPRMT5可以與AGO2結(jié)合，進(jìn)入RISC復(fù)合物。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)顯示，circPRMT5可以作為miR-30c的吸附海綿。使用生物標(biāo)記的circPRMT5探針，拉取與circPRMT5相互作用的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-30c可以被富集。FISh實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circPRMT5與miR-30c在細(xì)胞內(nèi)可以被共定位，因此作者挑選miR-30c作為circPRMT5的靶標(biāo)進(jìn)行后續(xù)研究。
后續(xù)研究證實(shí)，circPRMT5促進(jìn)UCB細(xì)胞遷移和EMT是通過吸附miR-30c，降低miR-30c的抑制效應(yīng)的方式行使功能。而且circPRMT5通過調(diào)控miR-30c/SNAIL1/E-cadherin通路，進(jìn)而促進(jìn)UCB細(xì)胞的EMT過程。最后，作者收集了正常人與UCB病人的血清和尿液中的外泌體，qPCR實(shí)驗(yàn)顯示從UCB患者的血清和尿液分離的外泌體中circPRMT5的表達(dá)量更高，miR-30c的表達(dá)趨勢，與circPRMT5的表達(dá)趨勢呈明顯的負(fù)相關(guān)。 |
研究意義：
本研究運(yùn)用Arraystar CircRNA 芯片研究膀胱尿路上皮癌（UCB）組織中circRNA的表達(dá)和功能。發(fā)現(xiàn)circPRMT5的表達(dá)在UCB組中顯著升高，并且與UCB病人差的預(yù)后相關(guān)。功能和機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，circPRMT 5通過海綿吸附miR-30c，調(diào)控SNAIL/E-cadherin信號通路，促進(jìn)UCB細(xì)胞系的EMT途徑和侵襲能力，意味著circPRMT5在UCB的轉(zhuǎn)移過程中起著促進(jìn)作用。進(jìn)一步，體內(nèi)干預(yù)circPRMT5實(shí)驗(yàn)表明circPRMT5是一個(gè)新的原癌環(huán)狀RNA分子。結(jié)果不僅僅闡釋了UCB轉(zhuǎn)移的新機(jī)制，也表明circPRMT5可作為UCB治療的靶標(biāo)。
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circRNA與疾病
近來研究開始關(guān)注于circRNA可能在疾病病理方面起到的作用。例如，環(huán)狀A(yù)NRIL（cANRIL）是長鏈非編碼RNA ANRIL的環(huán)狀拼接形式，其在人類細(xì)胞中的表達(dá)與該位點(diǎn)上幾個(gè)可能影響ANRIL拼接的SNP有關(guān)，能調(diào)節(jié)INK4/ARF的水平并增加動脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。這項(xiàng)研究充分證明circRNA與疾病的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，并能很好地作為疾病新型生物標(biāo)記。
此外，更多的證據(jù)顯示，環(huán)狀RNA在miRNA水平的微調(diào)上起著非常重要的作用，通過競爭結(jié)合miRNA來調(diào)控基因的表達(dá)。而與疾病關(guān)聯(lián)miRNA的相互作用則說明環(huán)狀RNA能夠參與疾病調(diào)節(jié)。可以預(yù)見，有miRNA的領(lǐng)域，就可能有circRNA功能的研究點(diǎn)。通過與疾病關(guān)聯(lián)的miRNA相互作用，circRNA在疾病中發(fā)揮著哪些調(diào)控作用，必將熱門。再加上circRNA穩(wěn)定不易降解，是否能作為生物標(biāo)志物，是否可用于診斷用途，也必然是熱門領(lǐng)域。例如，環(huán)狀RNA ciRS-7在人腦組織中豐富表達(dá)，與腦特異性microRNA miR-7相互作用；而ciRS-7含有多個(gè)串聯(lián)的miR-7結(jié)合位點(diǎn)，因此可以作為內(nèi)源性的miRNA海綿，抑制miR-7活性。考慮到miR-7是各種不同癌癥相關(guān)通路的重要調(diào)節(jié)因子，同時(shí)也因能直接調(diào)節(jié)a-突觸核蛋白和泛素蛋白連接酶A（UBE2A）的表達(dá)而可能與帕金森和阿茲海默疾病的發(fā)生相關(guān)，所以ciRS-7也很有可能作為神經(jīng)性系統(tǒng)疾病和癌癥發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子。
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案例展示：
案例一：整合分析mRNA-miRNA-circRNA測序數(shù)據(jù)揭示化學(xué)物致癌新觀點(diǎn)
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本研究以人類HepG2細(xì)胞為對象，利用高通量測序技術(shù)分析BaP作用過程中的致癌機(jī)制。整合mRNA、circRNA、miRNA測序數(shù)據(jù)（設(shè)置6個(gè)時(shí)間點(diǎn)），時(shí)序分析Bap處理對基因表達(dá)的影響。時(shí)序?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)miR-181a-1_3p隨著時(shí)間變化表達(dá)一直下調(diào)。作者以其為研究對象，尋找在BaP作用下的調(diào)控機(jī)制。靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)，有14個(gè)差異表達(dá)mRNA（包括DNA修復(fù)基因MGMT）和16個(gè)差異表達(dá)的circRNA具有miR-181a-1_3p的作用位點(diǎn)。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的變化，miR-181a-1_3p、MGMT和cirRNA具有一定的表達(dá)相關(guān)性。作者推測：在BaP作用下，會超量表達(dá)miR-181a-1_3p，從而抑制MGMT的翻譯，抑制DNA損傷修復(fù)；隨著時(shí)間的增加，circRNA的表達(dá)量增加，競爭性結(jié)合miR-181a-1_3p，從而解放MGMT，一定程度上對DNA損傷進(jìn)行修復(fù)。
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miRNA，mRNA和circRNA之間推測的ceRNA競爭關(guān)系
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案例二：神經(jīng)環(huán)狀RNA在發(fā)育期間調(diào)控突觸功能
最近，研究人員采用去除核糖體的RNA進(jìn)行深度測序，并結(jié)合計(jì)算工具，已從古生菌到人類等生物中發(fā)現(xiàn)了成千上萬條新的環(huán)狀RNA（circRNAs）。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，一些circRNAs可以作為”海綿”吸附miRNAs，從而阻止miRNAs與其靶基因的相互作用。circRNA也可以吸附RNA結(jié)合蛋白（RBPs），進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)相關(guān)RBPs或RNAs的運(yùn)輸。盡管在神經(jīng)元中已鑒定到其他種類的RNA（如miRNA，lncRNA）和基于RNA的調(diào)控模式，但卻少有circRNAs的研究。
研究發(fā)現(xiàn)，circRNAs大量富集于腦，來自于編碼突觸蛋白的宿主基因（圖1）。高分辨率的原位雜交顯示，circRNAs主要位于神經(jīng)元樹突（圖2）。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了circRNAs在發(fā)育過程中調(diào)控突觸功能，許多circRNAs會在突觸發(fā)生時(shí)突然地改變它們的豐度（圖3）。此外，在神經(jīng)活性自身穩(wěn)態(tài)下降后，許多circRNAs表現(xiàn)出明顯的上調(diào)或下調(diào)（圖4）。在本研究中，未發(fā)現(xiàn)腦circRNAs可以結(jié)合miRNAs和RBPs，或是翻譯出蛋白。
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不同組織中的circRNAs表達(dá)譜，揭示circRNAs富集于腦
a. 實(shí)驗(yàn)與分析流程，b. circRNAs的旋轉(zhuǎn)環(huán)形cDNA產(chǎn)物，c. 不同組織中環(huán)形測序數(shù)據(jù)占可比對基因組的測序數(shù)據(jù)的比例，d. 不同組織中產(chǎn)生circRNAs的基因占所有表達(dá)基因的比例，e. 不同組織中只在一種組織中表達(dá)的circRNA宿主基因的數(shù)量，f. 腦相比于其他組織，宿主基因位點(diǎn)上circRNAs與總轉(zhuǎn)錄物的豐度比例。
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腦表達(dá)的circRNAs來自編碼突觸蛋白的基因并富集于突觸組織
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腦circRNAs在發(fā)育過程中的表達(dá)譜變化
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circRNAs受到自身穩(wěn)態(tài)可塑性的調(diào)控
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案例三：鑒定植物中廣泛存在的非編碼環(huán)狀RNA
本研究以水稻和擬南芥為研究對象，進(jìn)行了全基因組范圍circRNA的鑒定，并對其特性進(jìn)行了分析。通過對水稻和擬南芥的RNA seq數(shù)據(jù)進(jìn)行參考基因組比對和過濾，判斷原始reads是否存在circRNA splicing，最后在水稻中鑒定到12,037個(gè)circRNA，在擬南芥中鑒定到6,012個(gè)circRNA。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，有700個(gè)外顯子circRNA的親本基因在水稻和擬南芥中為直系同源基因，表明植物中的circRNA具有較強(qiáng)的保守性。植物circRNA表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，27個(gè)外顯子circRNAs在磷酸鹽脅迫下出現(xiàn)差異表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，一些circRNA與親本基因的表達(dá)譜表現(xiàn)出顯著正相關(guān)。
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植物環(huán)狀RNA特征
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circRNA的高通量篩選及驗(yàn)證
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Arraystar circRNA芯片
最新版本人V2.0、小鼠V2.0、大鼠V2.0。從circRNA研究領(lǐng)域頂尖期刊和權(quán)威公共數(shù)據(jù)庫中收錄最可靠的circRNA。剪切位點(diǎn)特異性探針與RnaseR預(yù)處理雙重保障，特異性檢測circRNA。結(jié)果注釋詳細(xì)，提供circRNA可能結(jié)合的miRNA以及對應(yīng)host gene及線性RNA，便于從不同角度研究circRNA機(jī)制。
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circRNA qRT-PCR
康成生物采用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，針對circRNA特異的back splicing site兩側(cè)序列進(jìn)行引物(divergent primer)設(shè)計(jì)，該引物不受相應(yīng)線性RNA分子的影響，只會對目標(biāo)circRNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)對circRNA的表達(dá)的髙效、靈敏、準(zhǔn)確及特異性地檢測。
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環(huán)狀RNA的功能驗(yàn)證方法
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circRNA定量驗(yàn)證
circRNA定量驗(yàn)證手段與常規(guī)PCR手段不同，常規(guī)手段是圍繞目的片段的上下游分別設(shè)計(jì)PCR引物，稱之為convergent primer，需擴(kuò)增的片段位于上下游引物之間（如圖1.1）。而對于circRNA，尤其外顯子環(huán)化circRNA，除backsplice junction位點(diǎn)處不同于linear RNA之外，body區(qū)與linearRNA是一致的。因此，驗(yàn)證時(shí)需要特異性針對backsplice junction位點(diǎn)處設(shè)計(jì)primer，稱之為divergent primer（如圖），而且設(shè)計(jì)的PCR product的長度越短越好，可以增強(qiáng)backsplice junction位點(diǎn)處擴(kuò)增效率。
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圖1 convergent primer vs divergent primer
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為增強(qiáng)circRNA的驗(yàn)證效率，起始模版需滿足以下要求（3 free）：1. DNA free；2. rRNA free；3. linearRNA free。
驗(yàn)證策略：對3free RNA以及genome DNA同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測PCR product大小（如圖）。
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圖2 circRNA引物擴(kuò)增結(jié)果
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circRNA定位
位置決定功能。位于細(xì)胞核中的circRNA可能主要調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄，而位于細(xì)胞質(zhì)中的circRNA可能主要發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA—ceRNA的作用。用FISH(fluorescence in situ hybridization)熒光原位雜交技術(shù)來進(jìn)行定位分析，可觀察到circRNA在哪些組織中表達(dá)，作為組織特性判斷的依據(jù)。探針設(shè)計(jì)時(shí)需跨越backsplice junction位點(diǎn)區(qū)域。
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circRNA Northern blot驗(yàn)證
Northern blot方法是一種比較古老但行之有效的序列驗(yàn)證方法，需圍繞circRNA設(shè)計(jì)探針序列，而探針序列設(shè)計(jì)是驗(yàn)證成功至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。對于circRNA探針設(shè)計(jì)，我們建議以下兩點(diǎn)：1. 對于外顯子環(huán)化circRNA，建議探針盡可能跨backsplice junction位點(diǎn)；2.對內(nèi)含子環(huán)化circRNA，可圍繞內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)探針。
驗(yàn)證策略：對3 free RNA、total RNA以及genome DNA同時(shí)進(jìn)行雜交驗(yàn)證。
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circRNA過表達(dá)
circRNA過表達(dá)思想主要源于circRNA生物形成機(jī)制，已有多篇文章報(bào)道circRNA成環(huán)機(jī)制，目前比較公認(rèn)的成環(huán)機(jī)制為circRNA側(cè)翼序列的堿基互補(bǔ)配對，稱之為Alu結(jié)構(gòu)（如圖）。
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圖3 circRNA側(cè)翼結(jié)構(gòu)特征
基于circRNA側(cè)翼Alu序列特征，PCR擴(kuò)增含側(cè)翼Alu序列的目標(biāo)DNA序列，隨后依據(jù)對應(yīng)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行酶切，進(jìn)而連接pEGFP-C1載體。連接載體進(jìn)而轉(zhuǎn)染對應(yīng)細(xì)胞樣本，定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。基于divergent primer驗(yàn)證circRNA過表達(dá)倍數(shù)。
過表達(dá)策略：
1. 擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域包含circRNA側(cè)翼Alu序列或內(nèi)部堿基互補(bǔ)序列，側(cè)翼上下游1kb處過表達(dá)效率更佳；
2. 目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增基于基因組DNA為模版。
circRNA敲除
circRNA敲除思路主要針對circRNA backsplice junction處序列信息設(shè)計(jì)siRNA，對于內(nèi)含子環(huán)化circRNA，也可針對內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)siRNA進(jìn)行干擾。Divergent primer驗(yàn)證circRNA敲除倍數(shù)。
敲除策略：
1、外顯子環(huán)化circRNA，針對backsplice junction位點(diǎn)前后序列設(shè)計(jì)siRNA，如圖所示；
2、內(nèi)含子環(huán)化circRNA，除針對backsplice junction位點(diǎn)前后序列設(shè)計(jì)siRNA序列以外，也可針對內(nèi)含子區(qū)域序列設(shè)計(jì)siRNA。
3、每個(gè)siRNA設(shè)計(jì)對應(yīng)的對照，backsplice junction位點(diǎn)一端互補(bǔ)配對，另一端錯(cuò)配，如圖3所示。
圖4基于siRNA敲除策略
circRNA數(shù)據(jù)庫
circbase
在circBase（http://www.circbase.org/cgi-bin/listsearch.cgi）中，我們可以通過circRNA名稱（hsa_circ_0010153），轉(zhuǎn)錄本名稱（NM_133494），染色體定位（chr1:12359258-12382803）檢索circRNA的信息（序列，定位，gene_symbol等信息），你也可以直接檢索mRNA相關(guān)（TP53）或是生物學(xué)過程相關(guān)（apoptosis）的circRNA。
circBase有blat功能可以進(jìn)行序列比對，用于了解基因的物種保守性，不過物種較少
推薦使用UCSC（http://genome.ucsc.edu/）的blat功能
其實(shí)circBase的序列信息還是源于UCSC
但是在UCSC中直接用hsa_circ_0010153直接搜，還偏偏搜不出下面這樣的結(jié)果
點(diǎn)開一條序列，即可獲取該條序列的信息
前面在circBase中，我們已經(jīng)獲取了circRNA的位置信息了，所以就不需要再一個(gè)個(gè)點(diǎn)開查看基因序列了，直接在UCSC中輸入位置信息即可獲得完整的基因序列。
RegRNA2.0
那我們獲取了基因序列可以干嘛呢？第一反應(yīng)當(dāng)然是預(yù)測miRNA咯~
在RegRNA 2.0（http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/）中，我們可以用基因序列做很多事情，當(dāng)然也包括預(yù)測miRNA。
miRNA預(yù)測結(jié)果如下
circlnteractome
嫌上面這個(gè)預(yù)測circRNA的miRNA太麻煩？那你可以試試CircInteractome（https://circinteractome.nia.nih.gov/）
就是這么簡單粗暴
以上的檢索結(jié)果如果都不能讓你滿意，你可以試試曲線救國的方式，用circRNA的gene sybmol來搜索相關(guān)的miRNA，比如hsa_circ_0009973的gens symbol是VPS13D。不過這樣一來你得確認(rèn)circRNA與miRNA結(jié)合區(qū)域在mRNA和circRNA序列中都是存在的，如果結(jié)合區(qū)域由于剪切方式不同在circRNA中被剪沒了那就玩不起來了。此外由于circRNA是環(huán)狀的，所以在和miRNA結(jié)合時(shí)，自由能等等參數(shù)肯定會由于分子構(gòu)象發(fā)生改變，所以預(yù)測的準(zhǔn)確性也會打折扣。
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環(huán)狀RNA功能研究又一利器--過表達(dá)載體
吉賽生物利用專利技術(shù)，成功研發(fā)出特異性準(zhǔn)確過表達(dá) circRNAs 的表達(dá)載體，率先為研究者提供簡便高效的 circRNAs 過表達(dá)研究策略。現(xiàn)已推出 pCD-ciR、pLO-ciR 和 PLCDH-ciR 三種 circRNAs 表達(dá)載體，適用于普通真核表達(dá)，慢病毒包裝，綠色熒光和嘌呤霉素篩選等多種用途。
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升級版環(huán)形RNA數(shù)據(jù)庫
升級版的環(huán)形RNA數(shù)據(jù)庫CIRCpeida v2共收錄了6個(gè)物種（包含人、小鼠、大鼠、斑馬魚、果蠅和線蟲）中超過180個(gè)樣品的環(huán)形RNA計(jì)算分析結(jié)果。主要通過CIRCexplorer2和 MapSplice計(jì)算流程統(tǒng)計(jì)獲得了262,782個(gè)環(huán)形RNA分子，其中包括73,972個(gè)可變反向剪接事件。
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使用者可通過檢索和下載模塊獲取環(huán)形RNA基因組坐標(biāo)、表達(dá)水平、可變反向剪接、人鼠保守性等多樣化信息，通過瀏覽模塊在基因組上圖形化查看環(huán)形RNA具體表達(dá)模式，并通過新的在線分析工具對不同樣品中的環(huán)形RNA開展比較分析。
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