植物基因組內存在一類由基因反義鏈轉錄、與編碼RNA（mRNA）反向互補的非編碼RNA，稱作天然反義RNA（Natural antisense transcripts, NATs）。研究顯示，反義轉錄現象在大部分基因組內普遍存在，可與靶基因RNA序列反向互補，以轉錄后調控的方式干擾編碼和非編碼基因的表達和功能。同時，由它產生的RNA干擾作用是植物抗逆基因沉默或低水平表達的一個重要原因。除此之外，還參與RNA編輯、內含子不規則剪切、DNA和組蛋白甲基化和基因組印記(Genome imprinting)等生物化學過程和遺傳現象。

在自然界中許多高等植物需要通過冬季的低溫階段實現從營養生長到生殖生長的時期轉化, 這一生物學過程稱作春化作用。FLOWERING LOCUS C(FLC)作為一種重要的開花抑制蛋白負調控春化作用，參與植株從營養生長向生殖生長的轉化過程。

COOLAIR是植物體內天然存在的FLC反義轉錄本，擬南芥COOLAIR是具有典型的 5’帽子和3’POLY A結構的非編碼RNA。根據剪切方式的不同，COOLAIR又分為近端（ClassⅠ）和遠端（ClassⅡ）兩種類型。其中，COOLAIR ClassⅡ的遠端外顯子延伸至正向轉錄本的**個外顯子和啟動子區域，是典型的植物長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）。

研究發現，春化作用早期，FLC反義轉錄本COOLAIR LncRNA的表達量會在低溫脅迫下迅速上調，相反，FLC mRNA表達量下調。為了探究COOLAIR LncRNA在擬南芥FLC低溫誘導的表觀沉默過程中起到怎樣的調控作用，英國諾里奇研究所Stefanie Rosa研究團隊利用LGC Biosearch公司的單分子熒光原位雜交技術（Stellaris™ Single-molecule RNA FISH，后面簡稱Stellaris smFISH）對FLC正義轉錄本和反義轉錄本COOLAIR在細胞水平進行了亞細胞時空定位。

作者發現，在受到低溫脅迫時，多數情況下FLC正義轉錄本和反義轉錄本不會出現在同一細胞中，即便進入同一細胞，FLC和COOLAIR也會在空間定位上相互排斥（圖1）。通過Stellaris smFISH技術，作者發現低溫脅迫前4周，FLC成熟mRNA（主要定位在細胞質）熒光點逐漸減少，而前體mRNA（定位在細胞核）熒光點則在低溫脅迫2周后消失，因此作者推斷FLC mRNA的轉錄在春化作用早期就會關閉（圖2）。同時，COOLAIR的轉錄則在前2周被激活，多數細胞COOLAIR轉錄顯著上調，且在轉錄位點附近聚集成云狀（圖3），通過互斥關系促進FLC正義轉錄的順式關閉，再進一步通過改變H3K36me3組蛋白修飾（H3甲基化）動力學影響FLC基因轉錄（圖4）。

該文的重要意義在于首次利用Stellaris單分子熒光原位雜交技術從單細胞水平揭示了植物FLC基因正義轉錄和反義轉錄會在空間定位上相互排斥，證明了COOLAIR LncRNA在植物春化作用表觀遺傳沉默過程中發揮的作用，同時，建立了一項切實有效的方法來原位檢測擬南芥中單個RNA分子的定位和定量。

盡管RNA熒光原位雜交在許多模式生物中都取得了不錯的效果，但是受樣本特殊性以及體內自發熒光的限制，研究植物RNA分子單細胞之間的異質性和亞細胞定位一直以來都是一個瓶頸。Stellaris smFISH是一項能夠同時對單個RNA分子進行定位、定量和檢測的新型原位雜交技術，除了觀察RNA定位情況，還非常適合于分析基因轉錄位點活性、RNA-蛋白互作，以及RNA的轉位和遷移，除了應用在人、小鼠、果蠅、斑馬魚、酵母、線蟲、病毒等常規模式生物上，Stefanie Rosa的研究證明該技術對植物模式生物擬南芥也同樣適用，同時她相信，只要對前期樣本處理進行一定優化，應用于其它植物也不是問題，而植物綠色組織自發熒光的問題可以借鑒其它物種上的成功經驗，通過Tissue Clearing和冷凍切片進行克服。Stefanie聲稱，這項成果無疑為植物基因調控研究增加了新的強有力工具！

圖4：COOLAIR促進FLC正義轉錄的關閉及COOLAIR調控植物春化作用機制原理圖

隨著近年來編碼RNA/非編碼RNA研究進展迅猛，以及高水平雜志對數據準備性的要求越來越高，要確定前期篩選靶標的表達量、分子功能及作用機制，必須經過原位的驗證。對靶基因進行組織學水平或者細胞學水平的單分子RNA 原位雜交可以實現對研究對象的精準原位定量。除了是傳統蛋白水平IHC/IF和DNA 水平DNA FISH原位驗證的有力補充，Stellaris RNA FISH由于不受抗體的限制，在植物及微生物研究領域也有著獨特的優勢，且對于時下熱門的lncRNA、miRNA、cirRNA等不表達蛋白的非編碼RNA，也是絕佳的選擇。Stellaris smFISH技術自發明以來，以操作簡單、靈敏度高、特異性好且適用性廣而著稱，同時非常適合于多重RNA共定位，以及RNA-蛋白共定位。這項研究的共同作者Susan Duncan表示，她非常喜歡這項技術，因為她可以確切了解RNA的位置。“這非常直接。”她說，“實際上，這就是眼見為實。”

更多應用：
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參考文獻：
【1】 Rosa S, et al. Mutually exclusive sense–antisense transcription at FLC facilitates environmentally induced gene repression. Nature Communications. 2016.
【2】 Duncan S, et al. A method for detecting single mRNA molecules in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 2016.
【3】 Csorba, T, et al. Antisense COOLAIR mediates the coordinated switching of chromatin states at FLC during vernalization. PNAS. 2014, 111, 16160–16165.
【4】 張紹峰等. 植物非編碼RNA調控春化作用的表觀遺傳. 遺傳. 2012, 34(7): 829-834.

Stellaris™ smFISH是LGC Biosearch公司明星產品，基因有限公司作為LGC Biosearch授權一級代理， 自1992年成立以來，致力于為科研人員引進國內外先進技術，欲進一步了解Stellaris smFISH技術及更詳細的產品信息，敬請留言或直接聯系基因有限公司。