RNA的熒光原位雜交（FISH）長(zhǎng)期以來(lái)一直是用于檢測(cè)和定位RNA的不可或缺的工具，是其他基因表達(dá)分析方法重要的補(bǔ)充。覺(jué)得很復(fù)雜？只需不到一天就可以完成！

Biosearch提供了一種簡(jiǎn)潔的RNA FISH方案，可用于在固定哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同時(shí)成像多種原始和成熟mRNA、lncRNA、和RNA變體。該技術(shù)利用熒光預(yù)標(biāo)記的短DNA寡核苷酸（長(zhǎng)度約20個(gè)核苷酸），合并組成探針組（一組可多達(dá)48個(gè)獨(dú)立探針）。多個(gè)寡核苷酸與相同一RNA靶標(biāo)的整體結(jié)合，不需要酶反應(yīng)的信號(hào)擴(kuò)增，即可產(chǎn)生強(qiáng)熒光信號(hào)，顯示RNA或單RNA分子簇為點(diǎn)狀斑點(diǎn)。陽(yáng)性信號(hào)是由多個(gè)探針的組合定位熒光來(lái)確定的。單個(gè)探針的脫靶結(jié)合僅產(chǎn)生弱的和擴(kuò)散的熒光，遠(yuǎn)低于用于檢測(cè)特異性靶向的閾值；集體脫靶可能性很小，這使得假陽(yáng)性和假陰性的可能性都降至最低。這種設(shè)計(jì)使得Stellaris RNA FISH探針可以結(jié)合到部分降解的靶mRNA，使得它們非常適合福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織樣品。通過(guò)使用寬場(chǎng)熒光顯微術(shù)，這些點(diǎn)狀信號(hào)的可視化使得能夠?qū)�單個(gè)轉(zhuǎn)錄物的計(jì)數(shù)靈敏度精確至每個(gè)細(xì)胞一個(gè)拷貝。此外，通過(guò)使用具有不同光譜熒光基團(tuán)的探針組，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因特異性RNA或RNA變體的多重分析。

RNA FISH對(duì)于長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）尤其重要。lncRNA由于缺乏蛋白質(zhì)產(chǎn)物和通常存在多個(gè)剪接變體，作用機(jī)制不明確，對(duì)其研究頗具挑戰(zhàn)性。RNA FISH不單可以定位lncRNA，還增加了區(qū)分原始和成熟lncRNA轉(zhuǎn)錄物的能力，并由此得以將作用位點(diǎn)與合成位點(diǎn)分開(kāi)，可在轉(zhuǎn)錄事件和成熟lncRNA的位置和耐久性之間添加時(shí)間空間信息，是lncRNA分析的有用工具。

Biosearch用于檢測(cè)選定lncRNA靶標(biāo)的探針組，包含MALAT1，NEAT1 5'區(qū)段，NEAT1中間區(qū)段和XIST。以這些探針組定位的lncRNA能夠清楚的區(qū)分對(duì)位核斑體（paraspeckles）中的NEAT1，核斑體（speckles）與MALAT1。

Stellaris RNA FISH（熒光原位雜交）是一種RNA可視化方法，可使用寬視場(chǎng)或共聚焦熒光顯微鏡同時(shí)檢測(cè)，在亞細(xì)胞水平上對(duì)固定樣品中的單個(gè)RNA分子進(jìn)行定位和定量。一組Stellaris RNA FISH探針包含具有熒光標(biāo)記的多個(gè)不同序列的寡核苷酸，可沿相同靶標(biāo)共同結(jié)合到目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本上，產(chǎn)生點(diǎn)樣熒光信號(hào)。

Stellaris RNA FISH技術(shù)遵循一個(gè)簡(jiǎn)單的方案，無(wú)需使用外來(lái)試劑，價(jià)格經(jīng)濟(jì)，和平臺(tái)無(wú)關(guān)。當(dāng)天即可提供結(jié)果，樣品類(lèi)型和應(yīng)用類(lèi)型都可以多種多樣。 Stellaris RNA FISH探針甚至可以用幾種不同的染料標(biāo)記，以實(shí)現(xiàn)不同RNA靶標(biāo)的同時(shí)多重檢測(cè)。綜上，科學(xué)家可以以此追蹤基因表達(dá)的隨機(jī)性質(zhì)，不用分離純化和擴(kuò)增，通過(guò)直接檢測(cè)來(lái)觀察RNA。

靈敏度和特異性

Stellaris RNA FISH分析中的大多數(shù)探針確保兼具高靈敏度和高特異性。這種直接檢測(cè)方法的固有冗余度能保證假陰性和假陽(yáng)性信號(hào)的可能性最小化。陽(yáng)性信號(hào)是由多個(gè)探針的組合定位熒光來(lái)確定的。單個(gè)探針的脫靶結(jié)合僅產(chǎn)生弱的和擴(kuò)散的熒光，遠(yuǎn)低于用于檢測(cè)特異性靶向的mRNA的閾值。更重要的是，Stellaris RNA FISH探針可以結(jié)合部分降解的靶mRNA，使得它們非常適合福爾馬林固定，石蠟包埋（FFPE）組織樣品。

多重靶標(biāo)
Stellaris RNA FISH探針有多種熒光基團(tuán)可供選擇，包括Biosearch Technologies的CALFluor和Quasar染料，可用于多重靶標(biāo)測(cè)定。多重測(cè)定中的染料選擇在很大程度上由研究者可用的濾光片確定。可以設(shè)計(jì)包括DAPI核染+三種光譜重疊最少的熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的Stellaris RNA FISH探針組。

多重測(cè)定可用于鑒定多個(gè)基因之間的表達(dá)水平的相關(guān)性，同時(shí)運(yùn)行一個(gè)已知表達(dá)目標(biāo)的對(duì)照探針組。Biosearch提供了適用于人類(lèi)細(xì)胞作陽(yáng)性對(duì)照的目錄探針集。這些基礎(chǔ)基因探針集用Quasar 570染料標(biāo)記。

Stellaris RNA FISH還可以與現(xiàn)有技術(shù)如qPCR，DNA FISH，IHC（免疫組織化學(xué)）和western印跡結(jié)合以提供補(bǔ)充信息。

Stellaris RNA FISH方法 由四個(gè)步驟組成，不需要特殊的試劑，整個(gè)過(guò)程可以在不到一天內(nèi)完成。

步驟1：準(zhǔn)備樣品
樣品在＃1蓋玻片上生長(zhǎng)或粘附或切片，并用70％乙醇透化。在不同樣品類(lèi)型的樣品制備會(huì)有輕微變化。都不需要蛋白酶。

步驟2：雜交探針
對(duì)于大多數(shù)樣品，雜交可以在通常的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱中在+ 37℃下在4小時(shí)內(nèi)完成。

步驟3：洗滌樣品
雜交后，洗滌緩沖液短暫孵育以除去過(guò)量的探針。此步驟的總時(shí)間為1 - 1.5小時(shí)。

步驟4：樣本成像
樣品可以使用標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡成像。建議使用寬場(chǎng)熒光顯微鏡。共焦顯微鏡也可以使用Stellaris RNA FISH探針。

lncRNA研究案例：

來(lái)自麻省理工學(xué)院Tyler Jacks實(shí)驗(yàn)室的Dimitrova等人在Molecular Cell發(fā)表的一篇論文，使用Stellaris RNA FISH技術(shù)回答了關(guān)于“促細(xì)胞凋亡的lncRNA（lncRNA-p21）是否可以通過(guò)順式或反式作用機(jī)制調(diào)節(jié)來(lái)附近基因”的問(wèn)題。lncRNA-p21和p21的表達(dá)是響應(yīng)p53信號(hào)通路的活化刺激。這一通路涉及到腫瘤的抑制、并且是響應(yīng)DNA損傷和細(xì)胞應(yīng)激引起的，一直是一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。

研究人員想要研究lncRNA-p21作用于影響p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的機(jī)制。長(zhǎng)片段非編碼RNA能順式調(diào)節(jié)位于其轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)附近的基因的表達(dá)，有時(shí)其作用范圍會(huì)擴(kuò)展更遠(yuǎn)一些——作用于同一染色體上更遠(yuǎn)距離的基因。相比之下，反式作用的lncRNA作用于獨(dú)立位點(diǎn)，抑制或激活基因表達(dá)。

作者使用Stellaris RNA FISH進(jìn)行定位研究，并得出結(jié)論：lncRNA-p21以順式作用調(diào)節(jié)p21表達(dá)。首先，作者用TAMRA標(biāo)記的Stellaris RNA FISH探針顯示證明了lncRNA-p21定位于細(xì)胞核。然后，在缺乏lncRNA-p21的細(xì)胞中進(jìn)行陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其中超過(guò)90％的lncRNA-p21 -/- 細(xì)胞不含有l(wèi)ncRNA-p21熒光星狀RNA FISH信號(hào)。

接下來(lái)，作者通過(guò)針對(duì)lncRNA-p21內(nèi)含子、標(biāo)記有Quasar 670染料的Stellaris FISH探針，進(jìn)行單基因iceFISH（TM）分析，以鑒定其表達(dá)位置的基因組位點(diǎn)。iceFISH使用Stellaris探針靶向RNA內(nèi)含子。由于內(nèi)含子在剪接后迅速降解，因此可以測(cè)量積極轉(zhuǎn)錄的基因。由于內(nèi)含子探針標(biāo)記采用不同于外顯子探針組的熒光團(tuán)，因此作者能夠觀察到外顯子和內(nèi)含子lncRNA-p21信號(hào)之間的緊密共定位（參見(jiàn)下圖，這是如何工作的示例圖）。結(jié)果表明，這種特異的lncRNA可以通過(guò)順式機(jī)制作用于p21基因。利用Stellaris RNA FISH還另外收集了順式作用機(jī)制的進(jìn)一步證據(jù)：在lncrRNA-p21 -/- MEFs中，lncRNA-21的過(guò)表達(dá)不能挽回p21水平，并導(dǎo)致過(guò)表達(dá)的RNA在細(xì)胞質(zhì)的不當(dāng)定位和輸出。

iceFISH：使用Stellaris探針靶向RNA內(nèi)含子。因?yàn)閮?nèi)含子在剪接后快速降解，這就使得測(cè)量活躍轉(zhuǎn)錄的基因成為可能。