美國內華達大學和上海交通大學醫學院的研究者合作，利用Arraystar Mouse LncRNA芯片研究雄性種系發育過程中6個關鍵時間點的lncRNAs和mRNA表達變化。通過對這些lncRNA的序列分析和功能研究，發現在雄性生殖細胞發育過程中，lncRNA表達受到動態調控，lncRNA可以通過遺傳和表觀遺傳兩種機制，在轉錄和轉錄后兩個水平調控基因表達。該研究成果刊登在國際期刊BIOLOGY OF REPRODUCTION（影響因子4.027）。（芯片實驗由Arraystar提供技術服務）

研究背景：
雄性生殖發育是一個復雜的過程，受到表觀遺傳調控，包括組蛋白修飾和DNA甲基化等。LncRNA是近5年來生物和醫學界的熱門研究領域，在哺乳動物的轉錄組中，lncRNA的數量被認為遠超過mRNA。已經展開的大量研究表明，lncRNA在發育過程中有重要調節功能。大量lncRNA，尤其是基因間非編碼RNA（lincRNA），通過結合染色質修飾蛋白復合物參與到蛋白編碼基因的表觀遺傳調控中，并調控蛋白編碼基因的表達。但是，lncRNA在雄性生殖發育過程中的作用目前仍不清楚。此次中美兩國研究者合作研究的目的，是利用Arraystar Mouse LncRNA芯片對lncRNA在雄性生殖發育中的表達和功能展開系統研究。

研究思路：
為了系統研究雄性種系重編程和產后發育過程中的lncRNAs和mRNA表達變化，研究者采用Arraystar Mouse LncRNA芯片對6個關鍵時間點（E12.5, E15.5, P7, P14, P21, Adult）的lncRNA和mRNA表達進行分析，每個時間點取3對睪丸。結果發現，在雄性生殖細胞發育過程中六個關鍵時間點，均有成百的lincRNA和上千的lncRNAs表達上調或下調。然后挑選28個lncRNA進行了PCR驗證，驗證結果與芯片結果一致。

借助于生物信息學分析手段，研究者分析了lncRNA與臨近基因的位置關系，并結合mRNA的表達進行相關性分析，發現被高度調控的lncRNAs與臨近（<30 KB）mRNA基因簇的表達上調或下調高度相關。除了mRNA，研究者還分析了lncRNA與臨近的microRNA簇和piRNA簇的位置關系。

為了對lncRNA在雄性種系重編程和產后發育的功能進行研究，研究者首先通過ISH實驗研究lncRNAs的亞細胞定位，發現不同類型的lncRNA亞細胞定位不同，可能位于核內或細胞質中。研究者進一步通過RIP-PCR實驗，研究分別與染色質修飾相關蛋白EZH2和LSD1結合的lncRNA，發現與這些蛋白結合的lncRNA，既包括lincRNA，也包括非基因間的lncRNA（如反向互補lncRNA，雙向lncRNA等）。

結果表明，在雄性生殖細胞發育過程中，lncRNAs表達表達受到動態調控，lncRNAs可能通過遺傳和表觀遺傳兩種機制，在轉錄和轉錄后兩個水平調控基因表達。

技術路線：

結果展示： 

A． 雄性種系發育過程6個關鍵時間點的選擇；
B． Arraystar Mouse LncRNA v2.0芯片實驗流程；
C． 不同時間點兩兩比較的差異表達lncRNA(上圖)，以及差異lncRNA的分類統計結果（下圖）；
D． PCR檢測28個差異表達lncRNA的聚類圖；
E． 針對EZH2的RIP-PCR結果。

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研究意義：
該研究首次系統研究了在雄性種系發育過程中的表達并受嚴格調控的lncRNA。結果顯示，lncRNA轉錄組具有高度的異質性。在雄性生殖細胞發育的各個關鍵階段，lncRNA表達水平顯著變化。生物信息分析則揭示了大量新的lncRNA與潛在靶mRNA的聯系。RIP-PCR實驗則證明，lncRNA可以與重要的染色質重構復合物結合，參與表觀調控。該研究探索了lncRNA對雄性生殖細胞發育的調控作用，發現lncRNA可以在轉錄和轉錄后兩個水平調控基因表達，對于揭示雄性生殖細胞發育過程中的表觀遺傳調控具有重要的科學意義。

原文出處：
Expression Profiling Reveals Developmentally Regulated lncRNA Repertoire in the Mouse Male Germline. BIOLOGY OF REPRODUCTION.2013, 89(5):107, 1–12.
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