芯片作為一個成熟的技術平臺，幾十年來被廣泛用于基因表達譜的檢測。近年來，二代測序技術（Next Generation Sequencing , NGS）通過量化整個轉錄組上的轉錄本reads密度來檢測基因表達水平，被越來越多的應用于基因表達研究。長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNAs , LncRNAs）是長度超過200nt的非蛋白編碼轉錄本。LncRNAs在正常的生理過程和疾病中發揮重要功能，已成為科學研究熱點。對于LncRNAs基因表達譜檢測，芯片技術比RNA-seq有許多重要且不可替代的優勢，仍然是LncRNAs表達譜檢測的首選平臺（附表），原因有如下幾方面：

• LncRNAs比蛋白編碼RNAs表達水平低
• RNA-seq對于低豐度轉錄本的定量不可靠
• 增加測序深度不能提高低豐度轉錄本的檢測準確度
• RNA-Seq不能精確定量LncRNA與RNA-Seq數據分析不成熟密切相關
• 芯片比RNA-Seq更適合低豐度LncRNAs 表達譜的檢測

LncRNAs比蛋白編碼RNAs表達水平低

LncRNAs的一個普遍特征是表達水平很低[1-5]，LncRNAs的平均表達水平約為蛋白編碼基因的1/10[4-7] 

*圖釋：LncRNAs（藍色）和蛋白編碼轉錄本（紅色)在人體組織中的表達分布[7]。縱軸上的表達水平以log10RPKM表示。

RNA-seq對于低豐度轉錄本的定量不可靠

對于低豐度的RNA，由于測序深度有限造成的泊松抽樣誤差是RNA-Seq誤差的主要來源。因此，低表達的轉錄本不能被RNA-seq可靠檢測，需要進行富集檢測[8]。

在一個包含331M 50bp reads的RNA-Seq數據庫（三次技術重復）中分析發現基因表達水平與測量精度之間的聯系[9]。如圖所示，基因表達水平越高，定量越準確；反之，基因表達水平越低，定量的相對誤差越高。由于LncRNAs的表達水平遠低于蛋白編碼基因，絕大部分低豐度的LncRNAs無法通過RNA-seq準確定量（相對誤差高于20%）。

*圖釋：標準偏差與表達水平的關系。Y軸為三次技術重復的標準偏差，每個灰色點代表一個轉錄本。在陰影區，灰度代表密度，灰度越深，密度越大。如圖中所示，轉錄本平均表達水平越低，標準偏差越高；表達水平越高，標準偏差越低，定量越可靠，相對誤差低于20%。在RNA-Seq中，只有41%的轉錄本能夠被準確定量（水平虛線以下）；而對于高表達的轉錄本（垂直虛線右側），其中高達84%的轉錄本的定量是可靠的。這可以從垂直虛線右側而不是左側的高密度區落在了水平虛線以下看出[9]。

增加測序深度不能提高低豐度轉錄本的檢測準確度

增加RNA-Seq測序深度可以提高表達譜的檢測準確度。通常，100M reads對于大部分基因和轉錄本的檢測是足夠的，但如果要對多數（72%）基因的表達水平進行準確定量則需要500M reads[10]。然而，在對不同豐度的PHB、CD74和BRD4轉錄本亞型的研究中發現，提高測序深度能夠明顯提高高豐度轉錄本的檢測準確度，但是并不能提高低豐度轉錄本的檢測準確度 [10]。

總的來說，無限制的增加測序深度并不能無限的提高低豐度轉錄本表達水平的檢測準確度。由測序深度增加而提高的準確度將逐漸趨于飽和[9]。在RNA-Seq數據中，僅7%的高豐度轉錄本占總測序reads數的比例高達75%。增加的數據量絕大部分浪費在少量高豐度的轉錄本上，例如管家基因。這意味著低豐度LncRNA的表達水平不僅在通常的測序深度下不能夠準確檢測，即使盡可能增加測序深度也不能夠實現對低豐度LncRNAs的準確檢測。此外，隨著測序深度的增加RNA樣品中加工不完全的RNA檢出率提高，從而引起LncRNA檢測準確性的下降。

*圖釋： 定量可靠（誤差低于20%）的轉錄本數目與測序深度的關系。X軸的帶括號數字表示總測序reads數。額外的內部刻度線表示值得測序分析的測序運行數。右Y軸為所有已知的可被可靠定量的轉錄本的比例。小圓圈表示在完整的測序運行中的reads數（331M reads）。外推的S型曲線表示RNA-Seq能可靠檢測的轉錄本最多只能到60%，即使reads數達到10bn。

了解Arraystar LncRNA芯片的更多信息

RNA-Seq不能精確定量LncRNA與RNA-Seq數據分析不成熟密切相關

迄今為止，RNA-Seq數據分析方法在外顯子檢測及RNA定量等過程中存在諸多誤差。例如：1）對LncRNA外顯子序列的識別效率低。蛋白編碼基因的外顯子可以通過參考基因組上的翻譯起始位點，終止位點，以及剪切供體和受體位點直接識別，而LncRNA無法通過這些特征位點直接識別。此外，LncRNA的表達水平比蛋白編碼基因低，即使在相同的覆蓋深度下，檢測的靈敏度也低于蛋白編碼基因2）對LncRNA的組裝精度很低 (下圖)，而且無法通過增加測序深度提高組裝精度。這是由于RNA樣品中含有加工不完全的RNA或是轉錄噪音，隨著測序深度的增加它們被測出來的頻率越高，因此隨著測序深度的增加，組裝精度不斷下降。3）定量不準確。通過比較RNA-Seq與NanoString的結果發現：RNA-Seq的定量結果與NanoString之間相關性很低（R: 0.34-0.68），而且很多被NanoString檢測到的轉錄本通過RNA-Seq無法檢測到。

*圖釋：通過RNA-Seq數據進行LncRNA組裝的精度很低。圖中橫軸代表正確組裝的轉錄本占已報道的人類轉錄本的比例，綠點代表蛋白編碼轉錄本，紅點代表非編碼轉錄本（LncRNA）。能被正確組裝的蛋白編碼轉錄本不到已知轉錄本的30%，而能被正確組裝的LncRNA比例更低，只有不到20%。

芯片比RNA-Seq更適合低豐度LncRNA 表達譜的檢測

芯片的原理是通過與序列特異性探針的雜交識別RNA。對于特定的基因，即使雜交體系中存在高豐度的無關序列也不會影響該基因的雜交結果，因而對于低豐度表達譜的檢測幾乎無影響。而RNA-Seq的數據中，大部分測序reads被表達豐度很高的RNA如管家基因占據，從而導致低豐度的RNA只有很低的覆蓋深度。低覆蓋深度意味著低靈敏度和低可靠性。因此，芯片更適合低豐度RNA的檢測。例如，芯片一般能夠檢測到7000~12,000個 LncRNAs，而RNA-Seq 多達120M reads也只能夠檢測到1000~4000個 LncRNAs [11]。

雖然RNA-seq可以同時檢測已知和未知的序列，但隨著數十年的人類表達序列檢測的數據累積，RNA-seq能發現的新轉錄譜越來越少[10]。更多時候，RNA-seq文庫構建時產生的人為序列和不成熟的RNA會被誤認作新的轉錄本。隨著高級的芯片設計，轉錄本亞型可以被芯片上針對外顯子連接點的特異性探針所區分。涵蓋絕大多數已知和最新LncRNA并且能夠特異性檢測轉錄本亞型的芯片，由于具有比RNA-Seq更高的靈敏度，仍然是研究者的首選。

附表. Arraystar LncRNA芯片和RNA-Seq對LncRNAs表達譜檢測的比較

了解Arraystar LncRNA芯片的更多信息

參考文獻
1. Kampa, D., et al., Novel RNAs identified from an in-depth analysis of the transcriptome of human chromosomes 21 and 22. Genome Res, 2004. 14(3): p. 331-42.
2. Cawley, S., et al., Unbiased mapping of transcription factor binding sites along human chromosomes 21 and 22 points to widespread regulation of noncoding RNAs. Cell, 2004. 116(4): p. 499-509.
3. Ravasi, T., et al., Experimental validation of the regulated expression of large numbers of non-coding RNAs from the mouse genome. Genome Res, 2006. 16(1): p. 11-9.
4. Cabili, M.N., et al., Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev, 2011. 25(18): p. 1915-27.
5. Guttman, M., et al., Ab initio reconstruction of cell type-specific transcriptomes in mouse reveals the conserved multi-exonic structure of lincRNAs. Nat Biotechnol, 2010. 28(5): p. 503-10.
6. Yan, L., et al., Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol, 2013.
7. Derrien, T., et al., The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Res, 2012. 22(9): p. 1775-89.
8. Jiang, L., et al., Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res, 2011. 21(9): p. 1543-51.
9. Labaj, P.P., et al., Characterization and improvement of RNA-Seq precision in quantitative transcript expression profiling. Bioinformatics, 2011. 27(13): p. i383-91.
10. Toung, J.M., et al., RNA-sequence analysis of human B-cells. Genome Res, 2011. 21(6): p. 991-8.
11. Kretz, M., et al., Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR. Genes Dev, 2012. 26(4): p. 338-43.
12. Xu, W., et al., Human transcriptome array for high-throughput clinical studies. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(9): p. 3707-12.