生物通報道：基因組測序讓我們意識到，人類基因組只有一小部分被翻譯成蛋白質。其實我們基因組的80%會轉錄成RNA，但這些轉錄本大多不生成蛋白質。近年來人們發現非編碼RNA往往與人類疾病有關，不過絕大多數非編碼RNA的功能還是未知的。CRISPR/Cas9在這方面可以起到重要的作用。

CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR抑制（CRISPRi）特別適合分析非編碼RNA的具體功能。雖然越來越多的研究人員開始使用CRISPRa和CRISPRi，但它們其實還剛出爐不久。“我們都是這些技術的測試員，”加州大學的Jacob Corn說。

最近The Scientist雜志聯合CRISPR的開發者和使用者共同編寫了使用CRISPRa和CRISPRi的入門指南，幫助研究者們更好的研究和調節基因組的編碼和非編碼區域。

如何進入細胞

把Cas9蛋白送入細胞并不是一件容易的事，尤其是CRISPRi和CRISPRa中的改良Cas9。對于CRISPRa來說，構建始終表達Cas9或誘導表達Cas9的突變小鼠可以解決這個問題。此外，截短的引導RNA也不難進入小鼠。Konermann發現，14或15bp的引導RNA能包裝進病毒（腺相關病毒AAV更好），進而注射到小鼠體內。這種短RNA不能使Cas9剪切DNA，但可以招募轉錄激活子。

事實上研究者們已經發現了更小的Cas9。過去我們常用的是釀膿鏈球菌Cas9，其實金黃色葡萄球菌Cas9要小得多，可以包裝到AAV并進入細胞。雖然金黃色葡萄球菌Cas9靶標的位點要少一些，但對于轉錄激活來說這并不是什么大問題，Konermann指出。

測試多少引導RNA

與編輯蛋白編碼基因所用的sgRNA（約20nt）相比，研究非編碼RNA需要測試更多的sgRNA。Bassett進行基因編輯的時候通常設計三個引導RNA，但在CRISPRi中他會準備5-20個引導RNA。“在轉錄起始位點前100–200bp的區間中，我會盡可能多的嘗試，”他說。預測脫靶效應的計算工具可以幫助我們縮小引導RNA的選擇范圍。

用CRISPRa研究非編碼RNA需要測試的sgRNA就更多了，因為偏愛非編碼轉錄本的sgRNA并不那么好找。“可能我們所知的轉錄起始位點對非編碼RNA來說并不是那么合適，” Konermann說。“也可能非編碼RNA就是更難激活。”

非編碼RNA研究

CRISPRa和CRISPRi對非編碼RNA研究有很大的幫助。不過這些技術都面臨著一個問題，非編碼RNA（特別是長非編碼RNA）往往與蛋白編碼基因共享一個調控區域。這個問題很難避免，但并不復雜。我們只需要查一下附近的基因，就可以通過PCR或Western blot檢測這些基因的表達，了解它們是否與預定目標一同發生了改變。

雖然CRISPRa和CRISPRi很給力，但我們還需要通過其他途徑探索非編碼RNA的功能 。舉例來說，通過CRISPR基因編輯令非編碼轉錄本失活，有助于驗證我們的研究結果。“如果你認為某個長非編碼RNA有功能，最好從多種途徑來證明這一點，”斯坦福大學的Jens Durruthy-Durruthy說。他在Vittorio Sebastiano實驗室從事博士后研究，他所在的研究團隊正在使用張鋒的CRISPRa和傳統的CRISPR基因編輯，研究長非編碼RNA在人類發育和癌癥中起到的作用。

Weissman的研究團隊正在設計新的引導RNA文庫，以便更有效地靶標基因組的轉錄起始位點。O’Connell正在對自己開發的RCas9進行改造。RCas9識別和切割RNA而不是DNA，理論上特別適合非編碼RNA的功能研究。不過RCas9最初是在細胞裂解物中使用的，研究人員希望通過改良使其在細胞內有效工作。與此同時，研究者們還在尋找能夠直接編輯RNA的天然CRISPR系統，這樣的系統將更容易導入細胞。“我相信這樣的系統肯定存在，”Bassett說。

去年七月，美國麻省理工的副教授盧冠達(Timothy Lu)在Molecular Cell雜志上發表文章，闡述了一項最新技術在非編碼RNA研究領域的應用前景。這篇文章介紹了一個以CRISPR-Cas9為基礎的基因組靶向技術，CRISPR-Display (CRISP-Disp)。這一技術是John Rinn博士開發的，能將大片段的非編碼RNA送到指定基因組位點。研究人員摸索出的gRNA-ncRNA融合方法，能將非編碼RNA帶到特定DNA位點，同時不影響dCas9的功能和活性。盧冠達認為，這個系統在合成生物學和非編碼RNA機理研究中具有非常大的應用潛力。（更多詳細信息參見：盧冠達博士：用CRISPR揭示非編碼RNA的秘密）

能與指定目標匹配的引導RNA一般不止一條，我們需要為特定基因編輯任務選擇最佳的引導RNA。去年七月，哈佛醫學院的研究人員開發出了一種預測軟件。該軟件可以準確找出合適的引導RNA，以最有效的方式實現CRISPR-Cas9基因編輯。這項重要的研究成果發布在《自然方法》（Nature methods）雜志上。（更多詳細信息參見：遺傳學界大牛Nature子刊發布CRISPR-Cas9新工具）

上接：CRISPR功能研究入門指南（CRISPRa）

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生物通編輯：葉予

生物通推薦原文：Dial It Up, Dial It Down