主題四：PacBio RS系統在靶向測序和臨床診斷中有何獨到應用？

• SNP和Indel變異驗證、廣義單倍體型分析

Mauricio Carneiro：

“任何儀器如果只有隨機誤差，那反而顯得太棒了、太完美了，因為多測幾次或者提高覆蓋度就可以把隨機錯誤稀釋掉。所以當其他人被PacBio的原始高錯誤率嚇退的時候，我反而毫無顧慮�！�

目前研究人員對于突變數據的驗證一般采用Sequenom質譜、Sanger測序法。雖然這兩種方法的準確性很高，但是Sequenom方法對未知位點突變無法進行檢測，且很多分析仍然需要借助人工方法，而Sanger測序法通量低、花費大且同樣存在人工誤差的問題。此外采用多種測序平臺進行交叉驗證也大大降低了效率，且產生新的突變類型導致更加復雜的分析。所以，最好是利用已有的測序平臺直接產生高質量的測序數據，最大程度避免其他方法的交叉驗證。“基于這些考慮，我們對PacBio給予了厚望。隨著項目進展，現在它已經成為我們的標準工具。”

我們從千人基因組計劃產生的SNP數據中挑選了98個已經用其他方法驗證過的難測SNP位點，盡管之前沒人知道為什么這些位點那么難測，“但事實就是，這些位點在一般其他的測序儀上測的話總是一如既往地出錯”，所以這些位點就成了測試測序儀性能的標準。我們分別利用PacBio平臺和Illumina MiSeq平臺進行對比驗證，結果發現PacBio數據有著更好的準確性和假陽性檢出率，相對而言是一種更為有效的驗證工具。

注: 詳情請見參考文獻6、參考影像7/10、生物通往期文章1/2/3/10。

Matthew Meyerson：

Broad研究院正努力把PacBio做成基因分型、變異驗證與重復實驗的平臺，并專門為PacBio開發了補充算法，用于糾正其隨機誤差，并將新算法包含在GATK基因組分析工具包內。

“PacBio單分子測序技術能對基因組中的低頻變異進行高效解讀，且能夠有效彌補Sequenom和Sanger方法的缺陷，可以尋找除已知位點以外的其他漏檢稀有突變�！�

我們利用PacBio平臺對92株成神經管細胞瘤（Medulloblastoma）原代細胞株的全外顯子組的Illumina測序結果進行了體細胞變異位點的驗證分析。不僅驗證了所有發現的SNP，連（在CTDNEP1基因中）短到2 bp的微缺失（Indel）變異也得到了很好的區分和識別。我們最終確認了12個與成神經管細胞瘤發生相關的變異，并發現了一個以前從未發現的突變，為這種疾病的基礎研究和臨床診斷提供了新的分子標記物。

注: 詳情請見參考文獻5、參考影像7/10、生物通往期文章1/2/3/8/10。

Swati Ranade：
 
自ENCODE（DNA元素百科全書）信息公布以來，被認為是繼HGP之后的又一重大進展，相當于是給人類基因組繪制了一幅3D的Google Map。ENCODE里面提到，基因組中的垃圾DNA非但不是垃圾，而是龐大的控制面板，且存在超長距離的關聯。比如通常所說的編碼蛋白質的外顯子區域只占2%左右，但其實基因組中80%的DNA區域都是活躍的，即非編碼區域的功能之前被極大忽視。另外GWAS識別出的SNP變異僅12%位于蛋白編碼區，但疾病關聯的SNP有60%以上定位于非編碼區，這些區域經ENCODE識別具備功能，至少有400個熱點值得第一時間深入研究。所以說，ENCODE從基因組入手，GWAS從疾病入手，兩者結合，加上個體基因組信息，理論上可以預判疾病發生發展。

“這么一來，以往的研究就顯得視野狹窄了。比如以往只關注蛋白編碼區的SNP變異，或者僅在編碼區中進行SNP串聯的所謂‘單倍體型（Haplotype）’,那只能算是狹義的分型。業界漸漸意識到，‘廣義單倍體型’才是未來個體醫療真正需要的有效信息，即應該在基因編碼區和上下游非編碼區同時提取SNP關聯，并盡可能在更寬泛的DNA區域建立空間SNP（或Indel）串聯信息，因為可能還將涉及基因轉座、重組、同源簇等問題�！�如果說以往的研究無法關注廣義單倍體型是束手于技術，那么如今第三代單分子測序的出現將能在很大程度上為分型領域的研究作出突破。PacBio的長讀長特點可以幫助建立更直接更精確的大范圍SNP串聯，可以在單次測序過程中貫通編碼區和非編碼區。為了解決靶向捕獲問題，PacBio與Agilent合作，針對0.5 M染色體（Chr10+X）和3 M Kinome這些同時包含編碼區和非編碼區的人類DNA區域，分別嘗試了Agilent SureSelect的標準捕獲（200-250 bp）和為配合PacBio長讀長特點的2 Kb捕獲并進行測序比較，最終發現，“PacBio與Agilent SureSelect配合的最大好處是顯著提高了對以往難以靶向測序區域的覆蓋度，不僅可以在編碼區額外發現一些SNP變異，而且同時兼顧了編碼區和非編碼區的SNP關聯”。

此次與費城兒童醫院和賓夕法尼亞大學的合作，主要是在HLA分型中應用PacBio的長讀長測序特點。通過靶向測序進行HLA分型的意義不言而喻，但目前的確存在一些瓶頸制約，比如因HLA基因群高度密集而導致常規靶向捕獲效率低下、因短讀長測序定位困難而導致僅能實現在HLA有限的幾個外顯子中進行SNP/Indel Genotyping�！叭绻�說PacBio與Agilent的合作主要側重于靶向捕獲技術的突破，那么與費城兒童醫院的合作則主要側重于如何在HLA基因簇中進行盡可能全方位的Phasing而不僅僅是Genotyping（即廣義單倍體分型）�！�在初期方案中，我們先嘗試用長程PCR分別對HLA的A、B、C基因座進行擴增，涵蓋了所有8個外顯子和內涵子及上下游非編碼區，可以滿足在某個基因座范圍內進行Phasing�！�我們在20X覆蓋度下，可以在距離5 Kb的關聯范圍內發現成對出現的SNP和Indel親本雜合型變異，這樣的例子有8個�！�PacBio甚至還可以在包含高度重復序列的HLA-DRB基因中實現高度覆蓋�！半S著PacBio測序通量的進一步提升和測序成本的逐步下降，科研人員不光可以對MHC Class I和II的基因進行分型，還將有能力對所有MHC基因座進行大范圍分型�！�

可以說，PacBio的長讀長特點在靶向測序領域引入了一些新穎的應用，除了廣義單倍體型外，還可以應對復雜重復、可變剪切、轉座重排等，我們還在開發基于TdT末端延伸的方法，可以無需PCR、無需建庫（指兩端加莖環接頭的方式），有望在靶向測序的同時關注堿基修飾信息。

注: 詳情請見參考文獻10、生物通往期文章1/2/3。

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• 串聯重復突變和低頻突變檢測

Neil Shah：
 
FLT3過去一直被認為是急性髓細胞白血病（AML）的有效治療靶標，可患者接受靶向FLT3新藥治療后一段時間會復發，即很容易產生耐藥性，導致科研人員對FLT3是否是真正有效靶標的論斷產生了諸多質疑。

“但我們并沒有輕易放棄FLT3。”我們對8位白血病患者進行了分析，這些患者都是在二期臨床實驗中接受Ambit Biosciences研發的FLT3抑制劑AC220（Quizartinib）治療后復發的例子，表明患者出現了耐藥性。“我們決定用測序的方法對這些患者進行深度解析，看看FTL3耐藥性是否跟突變有關，并如何利用突變信息為未來的臨床診斷和新藥研發提供信息�！�

FLT3存在很多內部串聯重復（ITD）突變，距離激酶結構域大約800 bp�！拔覀儾聹y是否這些突變隱患是一早就存在的，一旦激活就會成為抗藥性突變，這樣我們就需要對大片段區域進行測序，讀長至少需要能應付1000 bp左右的長度，才能保證真實解析突變的重復性和相互之間的位置關聯，這樣我們自然而然就想到利用PacBio的長讀長優勢�！�

實際應用中，我們用CCS環形一致序列讀取模式獲得了平均讀長1.4 Kb的Reads�！拔覀儗�PacBio系統的測序結果非常滿意，它幫助我們在病患復發階段發現了大量的突變組合，遠比我們想象得復雜�！薄埃�測序方法）在不遠的將來會在臨床診斷方案決策過程中起到深遠影響，可以為我們提供大量有效的下一代治療方案�！�

在研究過程中我們還遭遇了第二輪挑戰，即怎樣檢測低頻突變并從常規的Base Call噪聲中凸顯出來。“我們知道標準測序法僅能檢測20%頻率的突變，這顯然不能滿足我們的需求�！彼�以我們一開始也不敢確定PacBio是否能應付。“但實際使用下來，我們低估了PacBio，在單分子檢測條件下，我們竟然能檢測到最低至2.7%的突變�！�

“這里需要明確的是，2.7%指的是在所有我們觀測的含有活性突變的等位基因中，有2.7%的比例是某一種形式的活性突變，并非是相對正常等位基因的低頻突變�！币环矫嫖覀兊挠^測樣本數足夠統計意義，另一方面相比其他方法我們確實從PacBio的長讀長數據中獲得了更多的信息。“盡管不好估計到底PacBio檢測敏感度是多高，但我們保守估計達到了1-3%的低頻突變范疇。”

“這個研究成果令我們大開眼界，沒想到FLT3的耐藥突變譜圖如此豐富�！蔽覀儽容^關注的是，何種耐藥條件下突變出現在DNA單鏈上，抑或何種耐藥條件下突變在雙鏈上都有分布，以及何種突變組合對應何種復發之后的其他并發癥�！叭绻�能準確了解基因突變出現在何時、何地、何種組合，以及耐藥性的并發性類型，那么對于新治療方法和藥物的開發無疑具有重要意義。換言之，我們認為FLT3仍然是當仁不讓的白血病潛在靶標，未來在此基礎上的二次新藥開發還有很長的路要走�！� “這些突變對于白血病細胞的生存極為重要。我們認為，如果有能力在這些新發現的FLT3耐藥突變上重新進行抑制，我們將有望再次開發出治療方案，這已成為未來靶向藥物研發的趨勢，并重燃用于急性髓細胞白血病治療的FLT3抑制劑的希望�！�

用PacBio應對低頻突變的例子不止一個。我們在2011年12月參加美國血液學學會第53屆年會時就公布過類似的例子，利用PacBio技術檢測治療后復發的慢性髓性白血�。–ML）病人中BCR-ABL激酶結構域的稀有突變�！癙acBio技術可以從大于850 bp的Amplicon中很好地區分突變類型到底是單倍體型還是二倍體型，對低頻突變的檢測靈敏度同樣高得驚人，我們有一個病人的樣本中檢測到的兩個單倍體型變異的突變頻率低至1%。此外，我們還發現了一個新穎的119 bp缺失變異�！�

注: 詳情請見參考文獻9、生物通往期文章1/2/3/9。

Andrew Kasarskis：

“通過對AML患者樣品中FLT3基因測序——這些患者接受靶向FLT3基因治療后復發，我們確定FLT3是一個有效的治療靶標，并且這也將有助于科學家們更好的理解這種類型白血病的生理機制，從而研發出新型藥物。除此之外，我們進行的上百個FLT3單分子測序，也有助于分析低頻罕見的耐藥性突變。這種技術上的提升能用于識別遲早會在病患臨床療程中出現的耐藥性問題，通過了解這些突變，我們能制定出更好的治療方案�！�

注: 詳情請見參考文獻9、生物通往期文章1/2/3/9。

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• 三聯核苷酸異常擴增分析

Paul Hagerman：

脆性X綜合癥是一類在基因型上非常特殊的疾病，它伴隨著X染色體上FMR1基因的非翻譯區CGG序列異常擴增�！叭绻�你從宏觀的角度去審視這個基因，你會發現（CGG片段異常擴增）與認知力和生殖功能受損相關，是自閉癥的其中一個主要誘因，也跟早期卵巢衰竭和單基因神經退行性疾病相關。如果做個統計，我們說到的這些病僅在美國就對應150萬確診患者。想象一下，如果有一套行之有效的篩查手段，那么事實上對應的患者將超過1000萬�！�

CGG片段異常擴增與發病程度的關聯主要體現在重復程度上，重復超過55次（Pre-mutation，前突變）就會出現神經發育障礙的臨床表型，超過200次（Full-mutation，全突變）就會導致FMR1基因沉默，出現脆性X綜合癥，重復越多，癥狀越明顯。另外，異常擴增過程中還涉及突變。“我們最近發現，CGG重復區中出現的AGG突變程度有助于判斷新生兒患脆性X綜合癥的傾向�！�比方說，一個攜帶前突變的母親在CGG重復區中擁有兩個AGG突變，那她生下一個攜帶全突變等位基因的嬰兒的幾率在15-20%，但如果她不含有AGG突變，那生下攜帶全突變嬰兒的幾率立即上升到80%左右。“我們剛才僅提到了相距30個核苷酸范圍內含兩個AGG突變的情況，如果把視野在基因組范圍內放大，那么差異將是天翻地覆。”大范圍序列的CGG重復和突變解讀無疑至關重要，“而且用測序法解讀CGG的重復次數是最簡便的臨床診斷方式”。

對脆性X綜合癥患者的CGG重復區進行測序存在諸多技術挑戰，精確解析重復次數以及發現內部突變都不容易實現。“二代短讀長測序技術無法勝任這項工作，如果僅能讀取幾百個核苷酸的長度，那你很容易就陷在CGG重復區內部了�！�請注意，這是個100% GC含量的區域，二代測序法根本無法跨越。而Sanger法也無法檢測超過100個以上的CGG重復，且生成的都是不連貫的信號，相當于我們無法獲得單堿基分辨率的測序數據。何況Sanger法的低效無法切實滿足臨床高效診斷的需求。也有科學家依賴于Southern Blot和PCR技術，以獲得大致的重復長度和AGG突變程度，但當重復區太長時，精確性太差且無法定位AGG。PacBio RS系統的出現確實是基因型異常疾病臨床診斷的福音，從原理上講，單分子測序幾乎不受高GC的任何限制，哪怕是100% GC含量，何況長讀長的特點完全可以應付高達1000次左右的CGG超重復，還有它的高速�！拔沂窃赨C Davis的基因組研究中心聽說了PacBio系統，隨后拜讀了一些PacBio發表的文章，我立即意識到，這就是我們想要的,并迫不及待地想嘗試一下”。

我們選擇用PacBio的CCS環形比對測序模式提高精確性，從大量擴增的CGG重復序列中產生高質量的測序數據�！拔覀冏C實了PacBio可以測超過750個CGG重復片段，并能夠精確定位AGG突變�！薄斑@種方法保障了單堿基分辨率，今后也能完整鑒定所有與疾病相關的等位基因，從而有利于準確及時的臨床診斷。”

一些攜帶脆性X突變的患者同時具備前突變和全突變兩種形式，即一條染色體上是前突變重復，另一天染色體上是全突變重復，額外還有AGG突變分布，是一種嵌合型突變（Mosaic Mutation），而且情況有些像癌癥中的體細胞突變異質性，不同細胞的嵌合型突變類型還不盡相同。含嵌合型突變的患者顯然要比僅含全突變的患者給出的臨床反饋要復雜得多�！澳切┖�較少重復片段的等位基因或次要等位基因（Minor Alleles）在很多情況下可以起到臨床診斷的決定因素�！�比如，全突變型等位基因不能產生FMR1蛋白，但另一個前突變類型的等位基因可以產生少量蛋白，那么最終病癥顯然要輕微得多，但一考慮細胞突變的異質性，治療方案的制定就顯得異常復雜。“所以如果我們能夠真真切切地指出那些嵌合型等位基因各自包含的具體信息，就會顯著改善我們對臨床診斷結果的認識。” “可以想象一下，如果患者僅有一條染色體是全突變模式，而一串相關的等位突變散亂地鑲嵌在全突變和前突變兩條染色體上，各貢獻1%的發病率，那么患者多大程度受到疾病影響完全就由這些等位突變的定位分布形式決定，用常規測序或Southern Blot的方法是無法看到這些精確信息的。之所以說PacBio如此強大，就因為PacBio可以一次看清楚所有的等位突變和定位，無論是稀有的還是常規的。它是單個單個分子測過去，之后的突變分析就變得跟數數那么簡單。”

PacBio的單分子實時測序技術可以對大片段重復序列區域進行直接測序，從而可以清楚地分辨出雜合型等位基因�！爱斘业谝淮温犝f這個技術的時候，我立即認識到這正是我們想要的機會。有了這個技術，你可以真正獲得每一個不同片段長度的DNA序列信息，并能分辨出99%以上的稀有等位基因信息�！薄癋MR1基因有太多的跟臨床診斷相關的功能特性，我們目前還未一一得知，有了PacBio SMRT測序技術，我們可以對所有這些等位基因進行測序，同時還可以對甲基化狀態進行評估�！�在測序的過程中發現，DNA聚合酶的實時動力學數據對重復區的周邊序列已很敏感�！斑@些發現為檢測CGG重復區域的表觀遺傳修飾奠定了基礎。”

“我們的發現將成為非常重要的科研工具，同時還將是非常重要的診斷工具，有望填補臨床篩查的空白或薄弱環節，對攜帶三聯核苷酸重復的人群進行普遍篩查，比如在現有例子中，可以對與神經發育、生殖缺陷、神經退行性疾病發生休息相關的FMR1基因的CGG重復區進行測序篩查�！�我們正在把研究成果轉化到臨床診斷的應用中去，把CGG重復區片段大小、次要等位基因信息、甲基化修飾等等跟臨床病患嚴重性或治療干預結果對應起來。比如我們最新的研究發現，某種藥物的最終療效就跟病患是全突變型抑或是嵌合型突變相掛鉤�！半S著對雜合型突變認識的深化，這完全有望成為藥物療效的預測手段�！�考慮到通量問題，我們還會適時引入Barcode進行混合樣本篩查，“最終的通量可以允許在可接受的價格范圍內進行基于基因分型的人群普篩”。

除此之外，我們還希望把PacBio應用到脆性X染色體癥的新生兒高通量篩查中去。“這個平臺具備快速篩查的潛能，然而其他現行方法無能為力�！�之所以需要快速篩查是因為臨床上已經具備早期干預的辦法，可以讓新生兒在確癥后立即接受早期治療。“我們希望在一到兩年內開發并驗證這套臨床診斷或快速篩查方法。我們的目標是把它應用到CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments，美國臨床實驗提高修正案）實驗室中去，而且義無反顧地去實施。盡管儀器比較貴，但如果能接受上千例的臨床診斷或快速篩查，這個費用就會被很好地稀釋掉�！�

PacBio單分子測序技術還可以應用于其他序列重復關聯疾病的臨床診斷，比如強直性肌營養不良癥（Myotonic Dystrophy）、亨廷頓氏舞蹈癥（Huntington's Disease）、弗里德里希共濟失調癥（Friedreich's Ataxia）、肌萎縮側索硬化癥（Amyotrophic Lateral Sclerosis）、額顳葉癡呆癥（Frontal Temporal Dementia）等�！皬膶嵱媒嵌榷�言，長讀長測序技術確實可以做到（針對序列重復關聯疾�。╅_發更優越的診斷流程。”

注: 詳情請見參考文獻7、參考影像1/6/11、生物通往期文章1/2/3/4/7。

Lisa Edelmann：

“盡管這篇文章只相當于一個PoP實驗，但它著實拓寬了人們的視野，開始關注臨床診斷的一些問題，比如，對大片段重復序列進行直接測序是否有助于判斷預后或療效�！�

Vincent Magrini：

三聯體核苷酸異常擴增與很多遺傳疾病發生相關聯，丘腦底核萎縮癥（Subthalamic Nucleus Atrophy）就是如此。該病癥調控關鍵基因ATN1第5號外顯子上含有CAG三聯體核苷酸重復，正常情況下從6個到35個重復不等，一旦超過48個以上就會引發丘腦底核萎縮。

“靶向測序法檢測CAG重復將是臨床快速診斷行之有效的方法�！盋AG區域極易形成發夾結構，二代測序過程中PCR無法正常跨越，且GC含量也相對較高�！暗�這些困難在單分子測序方法中就不算什么”。

為了響應快速診斷，臨床上有可能對混合樣本進行測序，所以我們有必要設計Barcode，以便區分混合樣本。二代測序法同樣也不適合混合樣本檢測，依賴PCR的測序方式會導致混合樣本中不同豐度的模板分子出現極大的擴增效率差異，從而導致最終結果失真。我們針對PacBio容易出現因插入而引起的隨機誤差的特點，用模擬算法篩選出了14對6位Barcode序列，這些Barcode序列在測序過程中有很高的插入誤讀容忍度，所以可以在第一時間相互區分出來，然后通過PCR法把Barcode連到待測樣本的擴增子上就可以了。

考慮到實驗漸進性，我們先做了個模擬實驗。我們把14對Barcode加到已知CAG拷貝數的ATN1第5號外顯子的擴增產物上，這些擴增子間只有濃度不同，不同濃度對應不同的Barcode，相當于人為在單一樣本中引入復雜性。最后我們發現這個方法還是行之有效的，我們用Barcode區分出了不同濃度，最終的PacBio測序結果也能真實還原CAG拷貝數。這一部分的工作我們還在繼續，期望這套方法能最終應用到臨床快速診斷上。

注: 詳情請見參考影像6、生物通往期文章1/2/3。

David Mittelman：

我們致力于在多種遺傳病中研究三聯核苷酸重復印記，這些疾病包括亨廷頓氏舞蹈癥（Huntington's Disease）、脊髓小腦共濟失調癥（Spinocerebellar Ataxias）等。在這些疾病中，三聯核苷酸重復可以連成幾百個堿基，不僅如此，重復程度還存在體細胞間差異（Somatic Variation），我們稱之為基因組重復區不穩定性（Genomic Repeat Instability）。用測序獲得重復區信息是最直接的方法，但目前用一代和二代測序技術都不是很奏效，“而PacBio第三代單分子測序技術卻可以在全長重復區段實現完整覆蓋，并確保不引入PCR偏好性”。

為了有效區分不同體細胞之間的差異性，我們在測序起始階段引入Barcode�！癙acBio在這方面的應用潛力巨大，它可以單分子的形式完整捕獲這些長片段重復區域，從而方便我們細致觀察不同細胞間的差異�！�確切地說，我們在開發一種針對三聯核苷酸重復相關疾病的新型療法。我們在2009年的PNAS上就發表了該項PoC（Proof of Concept）研究成果，用基因工程改良過的鋅指核酸酶來永久性地定向切除并縮短CAG三聯子重復序列。“如果你能把重復程度縮到足夠小，你就有可能推遲疾病癥狀的出現�！�用PacBio測序法不僅可以衡量鋅指核酸酶對三聯子重復區的切除效果，還可以研究重復區不穩定性。“PacBio有很多途徑可以令其在某個測序領域脫穎而出引領潮流，這個領域目前可以不熱門，比如我們說測三聯核苷酸重復。在個體診療趨勢下，不遠的將來人們將會在個體中研究遺傳印記多樣性，這就是PacBio的機會所在�！�我們目前的方法還需要PCR擴增，但未來將可以實現直接捕獲三聯子重復序列，或者至少可以做到僅需少量擴增�！翱傆幸惶欤�技術會強大到在病人身上獲取組織樣品并直接捕捉所需的DNA序列，然后用PacBio進行單分子測序，這將有助于降低分析噪聲。”

注: 詳情請見參考影像6、生物通往期文章1/2/3。

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• mRNA可變剪切和病毒變異分型

Frederic Bushman：

HIV-1病毒一直是我們實驗室研究的主攻方向�！癏IV-1只有一個轉錄起始位點，卻有多種剪切異構體，我們認為是研究可變剪切的非常好的模型。通過研究可變剪切我們可以了解病毒的復制過程。”

測序無疑是研究可變剪切最直接的方式，而且現在測序項目炙手可熱，但在選擇何種測序平臺上，我們在一開始就想了很多。“第二代測序平臺生成的片段過短，必須進行片段拼接，而拼接就會失去轉錄組可變剪切的真實信息，回過頭來還是需要通過猜測和推斷來分析剪切位點。而單分子測序則不同，其生成的長片段能一次性完成通讀，有助于在大范圍內對可變剪切位點進行直接分析�！�此外PacBio的CCS測序模式能夠提供準確度非常高的序列數據，使得轉錄組可變剪切位點分析更加準確。

我們先將HIV-1的轉錄組進行反轉錄，隨后用PacBio RS系統進行cDNA測序。通過分析，我們發現了109個HIV-1獨有的可變剪切產物，其中兩個還編碼新的蛋白。我們研究的價值更體現在，我們發現了HIV-1的剪切模式具有很大的異質性，即不同階段和微環境下剪切模式會隨之發生改變。這是一個很重要的發現，從一定程度上揭示了HIV病毒的高度變異性，有望為HIV病毒的反侵染和艾滋病治療研究提供寶貴線索。

HIV-1病毒是一種典型的RNA病毒，其基因組比目前已知的任何一種病毒基因組都復雜。“PacBio的單分子測序技術從原理上還有突破空間，比如有望直接對RNA進行測序，對于這一點我們翹首企盼�！�

注: 詳情請見參考文獻3、生物通往期文章1/2/3/6。

Michael Brown：

HIV-1病毒的基因組比已知任何其他病毒基因組都要復雜，由于部分HIV病毒會在感染初期逃脫體內的免疫反應，并通過快速的基因組重組而不被免疫系統識別，在受感染者體內存活下來并進一步繁殖。這樣在一個感染者體內HIV-1病毒就形成了一個以優勢株為主的相關突變株病毒群，即稱為準種（Quasispecies），以利于其在不良環境下生存。因此，目前研究認為準種分析與病毒的抗藥性有著密切的關系，例如臨床醫生如果可以方便的獲得患者血清中的病毒準種特點，又能清楚的了解不同準種對不同藥物敏感性的差別，就便于優化抗病毒治療藥物的選擇和方案的制定，從而提高病毒感染者抗病毒治療的效果。

“盡管二代測序可以提供高通量的測序數據，但是由于讀長短，因而不能覆蓋整個病毒分子基因組，所以也就不能確定多個突變位點是來源于一個分子還是不同分子。而PacBio長讀長測序可以直接輕松跨越整個HIV-1病毒基因組（9kb），因此非常適合發現結構變異。”

埃默里大學（Emory University）AIDS研究中心與贊比亞的研究組進行合作，研究HIV-1病毒在傳染的過程中準種的變化。以往他們采用的是單基因組擴增測序技術（SGA），即從病人的血漿中分離病毒并獲得其cDNA，然后進行有限稀釋直至每個孔里只有一個病毒基因組，再次擴增后進行測序并進行準種分析。利用該方法，在8-10天內只能完成30個病毒基因組的分析。隨后他們與我們進行了合作，希望用PacBio嘗試以期提高效率和分辨率。“利用PacBio單分子測序，由于每個ZMW即可以對單個DNA分子進行測序，因此在不到90分鐘的時間即可完成1000-3000個病毒基因組的分析工作�！�

準種分析表明，供體（Donor）體內的HIV-1可以分為6個Cluster，而在被傳染的受體內，只檢測到其中的一種Cluster。通過與之前的Sanger法的數據進行比較，我們發現PacBio的數據中，12個樣本是和之前的Sanger法完全吻合的，而在9個樣本中，每個樣本會有1-3個堿基的差異。通過對Sanger數據進行進一步分析，結果發現這些差異源于Sanger測序在進行Base Call的時候有的堿基被識別成了R。經過比對矯正，PacBio矯正了原有Sanger數據中的3948個錯誤的A位點。

注: 詳情請見參考影像9、生物通往期文章1/2/3。

Ellen Paxinos：

病毒耐藥性突變分型在慢性病毒感染等臨床診斷領域具有十分重要的意義。目前一般采用CE測序法，但受限于通量往往只關注重要的突變；二代測序由于采用PCR而存在可靠性方面的擔憂，同時不能實現線性定量并勝任低限檢測。因此我們在PacBio平臺上嘗試了HBV病毒的耐藥性突變檢測，希望能回答兩個主要問題，即檢測低限在哪和能否線性定量。我們擴增了兩個HBV基因組中的一段575 bp和1389 bp，每組片段中其中一個為WT，另一個為Mutant，含有三個位點的堿基突變。然后將WT和Mutant以不同比例混合，然后用PacBio檢測不同混合物中突變的頻率�！皢畏肿訙y序的可以檢測到低至0.078%的突變頻率，并且在不同的混合條件下保持了非常好的線性，并且由于PacBio的長度長可以準確的對病毒突變位點進行分型，這對于HIV-耐藥性研究具有重要意義。”

注: 詳情請見參考影像8、生物通往期文章1/2/3。

Jonas Korlach：

百日咳鮑特菌（B. Pertussis）是一種病原體，基因組大小為4 M，其中10%的區域為重復元素。盡管市面上有相應的疫苗，但有效性僅有80%，且逃逸疫苗治療的菌株數量還在進一步上升。該病原體基因組測序記錄之前僅有兩例，其中一例采用Sanger法測序，用了130000個 Reads，另一例采用454和Sanger混合測序的方法，拼出了300多個Contig，額外還需要10000個Sanger數據進行填補，可見病原體基因組測序在當今仍是難點。

在與荷蘭公共健康和環境研究所的合作項目中，我們對9個百日咳鮑特菌菌株進行了測序，其中包括一些疫苗逃逸菌株�；�本上，4-8個SMRT Cell就可以測完一個菌株，并拼成一個完整的Contig。“現在我們已經獲得了大量導致菌株間差異的結構變異信息。”通過繪制系統進化樹，可以幫助我們了解菌株間的親緣關系和進化次序。在進化樹中，早期用Sanger法測序的菌株離其他菌株的關系較遠，其中發現有4個轉座相關的移動元素（Mobile Element），而用PacBio測序的9個菌株中還發現了其他5個移動元素。

我們還測了幾株沙門氏菌（Salmonella），僅用了不到一個星期，其中包括一株10月份在亞利桑那爆發的菌株，在這個菌株中含有兩個全新序列的質粒，這些新穎序列現在已經可以用作臨床診斷的依據。除此之外，我們同時還觀察了表觀修飾信息，并發現了一種新穎的堿基修飾——硫代膦酸修飾（Phosphorothiation），即DNA骨架中非橋聯的氧原子為硫原子所替代，該修飾可能跟氧應激反應相關。

在與CDC和FDA的合作中，PacBio公司還測了16株利斯特桿菌（Listeria）并發現了一些特有的甲基化譜，其中包含一個在胸腺嘧啶上的修飾。

注: 詳情請見參考影像3/5，生物通往期文章1/2/3/4/5。

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• 臨床快速診斷實施和無需建庫方案

Andrew Brown：

新一代測序技術正在為癌癥研究帶來一輪前所未有的變革，全基因組范圍的信息可以提供一系列分子事件上的表征，這些表征對癌癥發生發展和手術預后等的評估意義重大。

OICR已經有兩臺PacBio RS系統，并正式投入到臨床診斷基因組學的應用中。我們需要測試這個系統把它發揮到最佳狀態，通過全基因組測序的方法解讀癌癥基因及其他癌癥治療敏感性或抑制性相關的遺傳標記�！暗侥壳盀橹�，共有30多個病人參與了我們的測試，在鑒定出的影響藥物療效的基因列表中，有2個以前從未報道過的可變剪切。隨后我們還將擴大關注基因的范圍，招募更多地病人參與其中�！�

注: 詳情請見參考文獻1/4/8、生物通往期文章1/2/3。

John McPherson：

OICR的目標是試圖建立起一套對癌癥病人的測序體系，這樣可以幫助醫生獲取更多信息，輔助做出更恰當的后續治療方案或臨床試驗安排，并希望最終能將這套體系應用于對癌癥病人的標準護理流程中�！拔覀兿Ｍ�在3周內就可以反饋結果，這個時間指從病人知情并同意到拿到報告，因此在測序環節的時間需要控制在1-2天�！�整個流程包括：病人簽署同意書，組織活檢、DNA抽提、測序、分析、驗證以及同臨床醫生和研究人員開會給出相關報告。“由于周轉時間的限制，PacBio RS系統快速測序能力也是我們選擇它的一個主要原因。我們擁有PacBio快一年了，它確實用起來又快又方便�！�同時，PacBio的序列無偏好性測序的特點也是一個重要考慮因素�！坝捎谖覀冃枰�塑造一套臨床診斷系統，我們必須保證在所要檢測的任何一個基因上都能達到100%的覆蓋率。” “Mate-pair和Paired-ends這些方法需要太多手工作業，何況還需要投入大量的起始量，真的是相對低效�！�

我們從PacBio上獲得的結果非常好，平均讀長在1800 bp左右。我們主要采用CCS環形比對測序模式來確保測序的準確性，并且獲得擴增子數百倍覆蓋深度的數據。

目前我們已經完成了對15個病人的測序，其中一半的病人19個基因中至少有1個發生了突變。隨后我們與加拿大瑪格麗特公主醫院Lillian Siu的一期臨床組合作，主要是用Sequenom的OncoCarta Panel試劑盒對OICR的測序結果進行驗證。幸運的是，PacBio沒有錯過任何一個OncoCarta Panel試劑盒檢出的突變，還能額外檢出試劑盒未涵蓋的新突變�！斑@就是我們為什么要做測序，我們希望能發現現有的檢測試劑盒未涵蓋的信息�！�

與此同時，OICR還希望他們的測序體系獲得CLIA認證。“把它變成CLIA實驗室的一部分需要做很多的努力�！�其中一個選擇就是把PacBio搬到已經成為CLIA標準的醫院實驗室中去�！安坏貌豢緾LIA實驗室去運行和驗證儀器。PacBio不會在近期就能投放到CLIA實驗室中，但我們正朝那個方向努力�！逼渌�小型測序儀，比如Ion Torrent PGM，由于廉價有可能吸引到CLIA實驗室的目光。“但它實在太新了，數據更新太快，CLIA實驗室反而不見得能接受，它希望看到一個更為穩定的平臺�！� 我們的二期測試要和多倫多3家醫院合作，需要把研究工作落實到CLIA實驗室中，將綜合考慮醫院的數量、實驗室空間和價格等等因素進行更大范圍測試和比較。

臨床診斷測序模式終將從靶向重測序逐漸向全轉錄組或全基因組方向轉移。加拿大公共衛生系統傾向于把它做成面向所有癌癥患者的保健標準，而非簡單地收費服務模式。“我希望能很快看到這一天�！�

注: 詳情請見參考文獻1/4/8、生物通往期文章1/2/3。

Janet Dancey：

PacBio在一期實驗中的數據確實非常鼓舞人�！拔蚁朊總�參與的人都會由衷地感嘆我們自己的發現，包括那些患者和臨床醫生。”先期用PacBio系統啟動了50個癌癥患者的測序工作，使用的平均覆蓋度為600X，所有檢測基因都100%覆蓋，沒有漏過任何一個堿基。這些結果增強了我們想把臨床診斷測序項目最終付諸實施的信心和決心。“我們目前對PacBio很滿意，相比較Sequenom Panel，PacBio不但沒有漏檢，而且還可以發現額外更多的信息�！�

注: 詳情請見參考文獻1/4/8、生物通往期文章1/2/3。

Eric Schadt：

我在西奈山醫院的授權是確保最大程度地利用病人提供的信息，即當病人跨出大門時，我們的臨床研究人員需要從大量的電子記錄中最大程度地汲取有效信息，從而指導病人得到更好的后續醫療。

西奈山測序平臺擁有2臺HiSeq 2000、2臺HiSeq 2500、1臺MySeq、1臺PacBio RS、1臺Ion Proton，測序平臺與遺傳檢測實驗室共享CLIA實驗室執照。這意味著可以形成一整套起始流程，從整合一系列組學方法，到建立疾病狀態預測模型，到匹配已有藥物所對應的關鍵致病基因，最終幫助發現并改善后續治療方案。在把海量信息整合的過程中，我們發現依靠PacBio的長讀長測序可以幫助我們更好地建立這樣空間關聯，這個方法無可替代，尤其是在基因組的高度重復區域和高GC含量區域。

因此我們計劃將PacBio測序平臺逐步應用到開發系列臨床診斷標準上，從自閉癥開始，接著是攜帶篩查、新生兒代謝疾病篩查、最終還將發布癌癥和其他相關疾病的基因篩查列表，目前該計劃正在尋求紐約州政府的批復。我們之前的工作基于國家已批準的方法，即Sanger測序法，用全基因測序的方法發現疾病關聯基因的典型突變�！霸赑acBio的幫助下，我們正在獲取國家認可的變異信息之外的包含在基因序列上的其他任何附加突變信息。”

我們在PacBio上已經獲得了1200萬Reads，測序深度達到10X以上，平均讀長為4066 bp，準確性達到99%以上。我們正在關注20種基因，均含有大量重復區域，用短讀長測序的方法很難解決，因此必須輔以PacBio。比如在測CACNA1A基因（與某種神經障礙相關）時，PacBio單次讀長就可以貫穿兩個相隔1 Kb的長重復區域。在測其他三聯核苷酸重復時，共10000個重復區，每個重復區含至少50個重復單元，PacBio僅用了10X基因組深度就可以覆蓋84%的重復區域。另外，在MHC測序項目中，PacBio找回了在Illumina測序過程中丟失的500 bp區域，并同時找回了在Illumina和454測序過程中同時丟失的雜合子信息。

西奈山CLIA實驗室即將獲批Illumina/PacBio混合外顯子組測序許可證，可以針對5 Mb大小的靶向捕獲進行測序，這些區域涵蓋大量通常難以測序的復雜基因結構。

注: 詳情請見參考影像2/5、生物通往期文章1/2/3/4/5。

Peter Pohl：

GATC Biotech公司從德國聯邦教育與研究部BMBF的KMU企業創新資助項目中獲資50萬歐元，將通過和子公司LifeCodexx合作的模式，在PacBio平臺上開發先兆子癇（Preeclampsia，指妊娠24周左右，在高血壓、蛋白尿基礎上，出現頭痛、眼花、惡心、嘔吐、上腹不適等癥狀）臨床診斷方案。在德國，先兆子癇發病率在孕婦中占到2-5%，成為準媽媽和未出生嬰兒的頭號殺手，這個現象不容忽視。我們公司將“立即投入到”PacBio單分子測序平臺的方法學研究中。利用單分子測序平臺，“臨床診斷的費用和周期將會大幅度下降”。

此外，GATC Biotech公司還從德國聯邦經濟技術部（Federal Ministry of Economics and Technology）獲資12萬歐元，將和蘇黎世瑞士聯邦工學院合作開發基于測序法的食品生產環節監控流程，追溯諸如奶酪生產過程中的腐壞問題，在這個項目中也將看到PacBio RS系統的身影。

注: 詳情請見生物通往期文章1/2/3。

Paul Coupland：

Sanger研究院首次研發出了一種在PacBio系統上無需文庫制備就能完成單分子測序的新技術，所需DNA樣品起始量可以低至1 ng�！斑@是首次實現了DNA單分子的直接測序�！�固然，這個新技術可以簡化基因組測序的標準流程及減少DNA樣品的測序起始量，但最大的好處其實是不再擔心文庫制備過程中的偏差問題。建庫過程中DNA樣本往往被擴增上千倍，樣本中基因量的線性關系就會出現偏差，用測序法進行定量就會受到影響。所以說無需建庫過程將大大提高測序的精確性，“你測序的樣品就是你手上實實在在的樣品”�！霸谧x長和精度方面不會有負面影響，因為PacBio已經是單分子測序模式了，這個方法只不過是跳過了文庫制備過程，從而直接進入測序環節�！�

“我們利用這種新方法，完成了病毒和細菌的基因組測序，發現即使是沒花大力氣進行條件優化，我們也能鑒定出是何種生物，并且就算這些生物體內帶有一些特殊的基因或質粒（決定抗生素耐藥性），或者譬如特殊DNA堿基修飾之類的遺傳信息，都不會影響基因組測序。”

“這項技術通過優化，將能快速、高效地識別醫院和其他醫療場所中的細菌和病毒，具有很大的應用潛力。而且這也將能提升序列的可信度，因為這一過程無需構建文庫�！� 我們希望無需建庫法可以在臨床診斷場合快速應用起來。“比如從一根藥用棉簽中就可以找出到底病人身上有什么樣的抗生素抗性基因�！�

注: 詳情請見參考文獻2、生物通往期文章1/2/3。

Harold Swerdlow：

無需建庫法能直接利用非常有限的DNA樣品，但同時也需要你在通量上做出一些放棄�！盁o需建庫法不適合那些需要得到很多Reads的項目，這是需要掌握的核心概念。但總有些項目你不需要這么多Reads，我們說這個技術可能目前還比較小眾，卻總有一天會在某些應用上非常管用�！�比如僅用了0.08%的覆蓋率我們就準確鑒定出了一種植物病原菌。還有諸如疫情爆發、急性病檢測等一些需要快速鑒定的場合。法醫取證可能又是另一種情形，比較講究“證據鏈”。“法醫實驗室中的樣品很容易污染或誤混合，但如果拿到樣品后直接測序，就不會有此類擔憂，證據鏈也得到了有力保障。”

注: 詳情請見參考文獻2、生物通往期文章1/2/3/4/5。

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參考文獻

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http://jco.ascopubs.org/content/30/6/647.long
2. Direct sequencing of small genomes on the Pacific Biosciences RS without library preparation. Coupland P, Chandra T, Quail M, Reik W, Swerdlow H. Biotechniques. 2012 Dec;53(6):365-72.
http://www.biotechniques.com/BiotechniquesJournal/2012/December/Direct-sequencing-of-small-genomes-on-the-Pacific-Biosciences-RS-without-library-preparation/biotechniques-338089.html
3. Dynamic regulation of HIV-1 mRNA populations analyzed by single-molecule enrichment and long-read sequencing. Ocwieja KE, Sherrill-Mix S, Mukherjee R, Custers-Allen R, David P, Brown M, Wang S, Link DR, Olson J, Travers K, Schadt E, Bushman FD. Nucleic Acids Res. 2012 Nov 1;40(20):10345-55.
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10. 137-P: SINGLE MOLECULE REAL-TIME SEQUENCING OF FULL LENGTH HLA CLASS I GENES – THE PROMISE AND CURRENT REALITY Curt Lind, Kate Mackiewicz, Jamie Duke, Ariella Sasson, Swati Ranade, Anand Sethuraman, Jason Chin, Jeff Robinson, Dimitri Monos. Human Immunology. Volume 73, Supplement, October 2012, Pages 135. ASHI 2012 Puerto Rico Abstracts Issue.
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0198885912004284

參考影像

1. Customer Story: Exploring the Genetics of Fragile X Syndrome, Paul Hagerman (UC Davis)
2. PacBio AGBT 2013 Eric Schadt
3. PacBio AGBT 2013 Korlach-Webinar
4. Virtual Poster – Barcodes Allow for Sample Multiplexing with SMRT DNA Sequencing, Kevin Travers (Pacific Biosciences)
5. Virtual Poster – Evaluating the Potential of New Sequencing Technologies for Genotyping and Variation Discovery in Human Data, Mauricio Carneiro (Broad Institute)
6. Virtual Poster – Genome Variation in Chronic Viral Infection - SMRT Sequencing for HCV, Ellen Paxinos (Pacific Biosciences)
7. Virtual Poster – Single-Molecule HIV-1 Full Genome Sequence from Linked Transmission Pairs, Ellen Paxinos (Pacific Biosciences)
8. Webinar: Data Processing and Analytics for Follow-up Validation in Resequencing Projects, Mark DePristo (Broad Institute)
9. Webinar: Sequencing The Unsequenceable - Expanded CGG-repeat alleles of the fragile X gene, Paul Hagerman (UC Davis, School of Medicine)

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2. PacBio RS第三代單分子測序系統全球訪談紀要（二）
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4. PacBio堿基修飾分析標識微生物、病原菌的表觀遺傳學標志
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