主題二：PacBio RS系統在de novo測序中的優勢具體來說如何體現？

• 利用PacBio RS系統獨立完成微生物de novo完整測序

Michael Hunkapiller：

“PacBio正逐漸成為基因組譜圖完整化的金標準，它的技術亮點尤其體現在微生物領域�！�

 

Eric Schadt：

“這些微生物對我們的影響程度遠比我們的想象要深遠得多，即使在微生物世界也存在超乎想象的復雜交流網絡，所以我們首次有能力在全基因組范圍內解析微生物結構的勝利，在微生物界是一個實實在在的革新。”

我們對疫情爆發菌株采用PacBio單分子測序的方法，依賴長讀長優勢獲得的基因組序列包含33個Contig，這比早期報道的用NGS測序法獲得的包含超過300個Contig的結果優化了10倍。再結合已有的二代數據，我們最終把Contig數縮減至1個。“PacBio RS平臺的通量足夠在一天之內完成對微生物基因組的完整測序。”

“從樣本制備到測序結果，平均只需8小時，平均讀長為2,900 bp，而最長的讀長達到7,800 bp，再結合CCS環形一致序列測序模式，實現了非常高的單分子準確性，最后完整拼接。在此項目證實了PacBio在復雜微生物病原體的de novo測序的能力，以及在多個基因組快速測序上的威力，這些有助于闡明病原體微生物的進化史。”

“我們的測序方式有別于其他組織的工作�！痹缙诠ぷ鲀H對一種菌株進行測序，這樣的結果根本無法真實地揭示出致病菌株的起源和進化史。我們則用PacBio總共測了1個疫情爆發菌株、6個非洲臨床分離的EAEC菌株、及5個EAEC參考菌株共12株，在與爆發菌株相同血清型的多種菌株中進行對比，同時調用了之前41株菌的測序信息。比較的重心不僅落在SNP差異上，同時還落在結構變異上。

“我們最終的發現跟早期結果恰恰相反，疫情爆發菌株的起源應該是腸聚集性菌株EAEC（而不是腸出血性菌株EHEC），我們在9種同一血清型的菌株中進行了序列對比，它們跟疫情爆發菌株吻合得天衣無縫。這兩種菌株有根本區別，話說回來細菌確實很懂得偽裝�！�PacBio長讀長的特點非常適合于發現結構變異，我們在疫情爆發菌株中就發現了這么一個特有的結構變異，而在其他組織公布的爆發菌株序列中就沒有涵蓋該信息。這就說明如果只用二代的數據，那么結構變異的信息就可能會完全丟失，或者說二代技術需要和其他技術手段結合才能夠彌補。

我們絕不是運氣好，在年初解讀海地霍亂疫情爆發菌株時，PacBio RS系統的威力就開始呈現了。我們僅用了一個月左右的時間完成分析并發表結果，只需要3個小時就可以得到5個菌株12X覆蓋度的數據。

注: 詳情請見參考文獻5/7、參考影像4/6、生物通往期文章2/3。

Hyun Park：
 
極地微生物生存在正常生物無法生存的環境中，具有很大的研究價值。最好的方法是對極地微生物進行de novo測序，從根本上揭示它們的生物學信息。“然而，極地微生物基因組中的GC含量普遍較高，這種極端性會給de novo測序帶來很大難度。”

盡管一開始我們就有心理準備，但項目開展過程出現的接踵而來的苦難遠遠超出我們的想象。我們真的吃盡了苦頭，因為我們面對的是一株GC含量高達71%的極端菌株，基因組大小在7.6 M。“誰想得到，即使利用Illumina平臺進行200X深度測序，仍無法獲得完整的基因組圖。這還僅是個小基因組，組裝時竟然產生了185 個Contig，而且缺口數量太多，根本無法通過Sanger法有效補齊�！�

“我們別無他法，只好求助于PacBio，因為從原理上講，它沒有GC偏好性，這點將對我們幫助極大。最后我們僅僅用15X覆蓋度就能組裝得到26個Contig，缺口數量也大大減少，最終首次獲得了該細菌的完整基因組信息�！�

注: 詳情請見生物通往期文章4。

Timothy Smith：
 
“如果是從疾病的臨床診斷角度而言，我們是沒有必要要求所有的諸如傳染病源微生物的基因組圖都是完整的組裝圖，也沒有必要為了分析遺傳變異而對病人個體通通進行de novo完整測序。從這個角度出發，拼個草圖甚至搭個基因組框架就夠了，NGS的數據在很多場合就可以做到了，可能連混合拼接的方法都用不上。但是，請千萬不要忘了，擁有一些至關重要的微生物完整基因組結構圖的需求是一直存在的，尤其是比如出現在某種傳染病暴發或重大研究項目等情形中。”

“（在羊病微生物基因組de novo測序項目中）我們利用PacBio大于6 Kb的讀長數據，只用了20X覆蓋度就拼出了1個Contig，而且這一個Contig即是一條染色體。同時，我們發現混合拼接也是行之有效的方法，不再需要人工拼接的繁瑣過程，既快又省。我們在這方面就頗有心得，我們用PacBio的ToCA算法來糾錯，結合OLC方法進行拼接，最后得到幾近完美的微生物基因組圖�！�

注: 詳情請見參考影像9、生物通往期文章2。

生物通往期文章
1. Nature子刊：單分子測序揭示鸚鵡模仿能力
2. PacBio RS第三代單分子測序系統全球訪談紀要（一）
3. 單分子測序技術助力歐洲大腸桿菌研究
4. 單分子測序解決“極端”基因組組裝難題
5. 單分子測序輕松升級參考基因組

• PacBio系統結合二代測序技術進行高等基因組的混合拼接

Christopher Mason：

我們發現，PacBio的長讀長優勢不僅可以應用到微生物基因組de novo完整測序中，還可以應用到大型基因組的草圖升級工作中。比如我們在馬達加斯加指猴（Aye Aye）基因組測序項目中，僅用了0.5X覆蓋度的PacBio長讀長數據（C1試劑），就可以對原始38X覆蓋度的Illumina短讀長數據拼接起到令人震驚的促進作用。“長讀長數據幫助我們把大量的短小Contig進行橋聯，效果明顯，省了不少后期的拼接時間。”最終無論是Contig數量還是Scaffold數量都縮減至原始的1/10，N25和N50提升了2-3倍，N75提升了近10倍。

注: 詳情請見參考影像2/3/5。

David Jaffe：
 
眾所周知，NGS的廣泛應用使我們輕松獲得了無數基因組草圖，但隨后的基因圖譜精細化或者說填縫過程主要還是依賴PCR和Sanger測序，這個過程太昂貴太痛苦了，翻來覆去的猜測、微調、人工糾錯等過程，用計算機術語來講就是“迭代”。

“誰都不希望看到這樣，因為歷經多年耗資龐大，但真正完成的真核大基因組寥寥可數，即使如微生物這樣的小基因組，由于存在某些區域的堿基復雜性，真正完成的微生物基因組完整圖也不多。所以我們決定接受這樣一個挑戰，我們的初衷是想把基因組組裝工作從昂貴、費時、繁瑣的人工時代拉入到一個全新的低耗全自動時代。”

盡管Illumina的錯誤率比PacBio低，但它的讀長太短，給拼接工作帶來很多麻煩。“鑒于取長補短，把Illumina和PacBio結合起來是行得通的。”

“我們同時也看到了PacBio數據里所包含的Illumina無法給出的信息，比如PacBio測序前DNA無需擴增，用DNA聚合酶進行單分子合成可以跨越基因組上一些以往Illumina無法到達的高GC和高重復區域，最終在基因組的覆蓋程度達到空前的一致，這一點太重要了�！�

我們研究組先用Illumina數據拼出了Rhodobacter細菌的Scaffold，然后用PacBio的長讀長數據去填補Gap。在加入PacBio數據之前，一個Scaffold包含22個Contig，加入PacBio數據后，結果立即改觀，“拼成了一個巨大的Contig”。接下的工作，我們期望把PacBio長讀長的優勢最大化發揮，比如應用到微生物De novo測序和SNP驗證中。

我們同期啟用了三套數據，Illumina的Paired-end數據、PacBio數據（C1試劑）、以及跨長片段接頭處的Jumping-pair數據，發現無論如何拼接，長度長數據對獲得良好的基因組裝配結果是必須的，而Illumina短片段數據可以被去除，因為Jumping-pair數據就可以提供足夠精確的覆蓋度了，今后隨著PacBio的長讀長和自我糾錯能力改善（比如HGAp和Quiver），可能Jumping-pair也不需要了。通過這個辦法，我們共測了16個細菌樣品，其中有3個已經存在完整的參考序列。“我們驚人地發現，其中2個已有的參考序列還不如我們這次測序的結果來得精確�！�

談到花費，混合拼接的方法至少幫我們從試劑和人力消耗上省掉了12000美金。
 
我們開發的這套新型算法已經整合到了Broad研究院之前開發的ALLPATHS-LG軟件里，輸入長讀長數據后該模塊會自動啟動，組裝出完整的基因組。“在混合拼接基礎上，我們還將對外提供微生物基因組測序、組裝、精細化等服務，專門成立一個服務中心。”
 
當下確實也沒有其他方法可以提供類似于PacBio給出的超長且覆蓋不失公允的讀長信息，對大型基因組的組裝探索我們還在繼續。

注: 詳情請見參考文獻1。

生物通往期文章
1. Nature子刊：單分子測序揭示鸚鵡模仿能力
2. PacBio RS第三代單分子測序系統全球訪談紀要（一）
3. 單分子測序技術助力歐洲大腸桿菌研究
4. 單分子測序解決“極端”基因組組裝難題
5. 單分子測序輕松升級參考基因組

Michael Schatz：
 
我們的項目集中在基因組組裝上，主要是最后一步修補基因組缺口環節。以往的方法當然是Sanger法，這是昔日的金標準。“隨之而來的是二代短讀長技術，這個技術固然有它的優點，比如花費最少，但在組裝環節更多的效果是南轅北轍。”二代數據產生的最大特色就是海量的Contig、重復序列、以及某些特殊區域的缺失。如果不是花費問題，我們寧愿用Sanger法組裝，而不是一味用二代提高覆蓋度。

“因為我們心里很清楚，短讀長里面就是無法包含我們想要的信息�！�當PacBio的長讀長技術出現的時候，我們眼前一亮，覺得可以一試，以便走出多年受困的陰霾。“三代長讀長所包含的信息要遠遠超過二代短讀長。對于短讀長，哪怕無限制地提高覆蓋度也不能解決復雜區域的測序問題。但長讀長可以跨越這次復雜區域，因此不需要太高的覆蓋度就可以對付。同理，長讀長也可以用于檢測并鑒定單倍體型和轉錄本的可變剪切。”

“我們想到的辦法就是結合二代和三代各自的優勢�！�為了應對三代測序中出現的堿基錯誤問題，我們開發了一種糾錯算法，用二代短讀長高精確數據對三代長讀長數據進行糾錯，這個方法我們把它叫做“混合糾錯拼接”。通過混合糾錯法，我們發現“數據幾近完美”。

我們先后嘗試了幾種方案，先是采用Illumina短讀長數據進行組裝，用PacBio長讀長數據進行比對，結果發現弄不下去�？傆羞@樣那樣的問題困擾短讀長組裝，比如片段太零散或者局部坍塌，很難有效利用起來。“于是我們放棄了這種我們戲稱為‘暴力拼接’的方式，取而代之以先糾錯后組裝的方法�！�即用Illumina短讀長數據先給PacBio長讀長數據糾錯，再用修正過的長讀長數據組裝。我們也同時采用了用PacBio的CCS數據為長讀長數據糾錯，效果同樣好。“所以我們講的‘混合糾錯拼接’方法是一個廣義的范疇�！�我們設法升級了公共基因組裝配程序Celera Assembler，生成的裝配結果準確性達到99.9%，Contig平均長度是NGS所能達到的兩倍以上。

談到經驗就不能一概而論了，但我們試下來，對于短讀長，無論產自Illumina還是454甚至或者是PacBio CCS模式，短讀長的覆蓋度達到25-50X就足夠了，對于PacBio的長讀長覆蓋度要求不高，適中就可以了。有長讀長幫忙，使得“一條染色體，一個重疊群”的目標實現變得清晰。

為了驗證這個算法，我們嘗試了多個生物物種測序應用，小到噬菌體病毒，中到酵母、玉米，大到復雜的鸚鵡基因組，都得到了正面反饋。

“高效快速的de novo拼接有助于發現大片段的結構變異，對理解癌癥基因組和存在融合基因、拷貝數變異和大范圍結構變異的疾病遺傳變化具有重要意義�！�

注: 詳情請見參考文獻2、參考影像7/10/11/12、生物通往期文章1/2。

Adam Phillippy：

我們率先使用Illumina或Roche 454等二代短讀長數據去為PacBio單分子長讀長數據進行糾錯，并開發了一套糾錯算法。接著我們在多種物種中驗證了這一糾錯算法，比如大腸桿菌基因組、酵母基因組、以及玉米轉錄組等，發現可以把單分子測序正確率從83%提高至99.9%。我們還將這一混合糾錯策略應用到高等物種比如虎皮鸚鵡基因組測序項目中。

在未來的工作中，我們希望把這套算法應用到人們經常忽略的基因組非編碼區中。“人們用測序法往往只關心編碼基因信息，這樣的話就丟失了基因的結構信息。非編碼區包含的結構信息之前從未被清晰揭示過，這些區域包含太多大片段的重復序列，無論是讀取還是組裝，用二代短讀長的方法可以說是捉襟見肘�！�

注: 詳情請見參考文獻2、參考影像7/10/11/12、生物通往期文章1/2。

Erich Jarvis：

我們致力于鳥類鳴聲系統研究，認為不同物種間的鳴聲學習方式不同源于編碼蛋白的表達量不同，而非蛋白種類的不同，這一結果我們猜測由基因的非編碼區結構不同導致。“如果沒有一套行之有效的非編碼區組裝方法，那么我們輕易下手做這些實驗就等于是異想天開�！�

注: 詳情請見參考文獻2、參考影像7/10/11/12、生物通往期文章1/2。

Elaine Mardis：

混合糾錯后獲得的長讀長數據非常適合于一些特定場合的研究。“比如混合糾錯對轉錄組研究可能很管用，因為單次長讀長就可以跨越整個mRNA，所以可以很好地解讀可變剪切的多種方式，即為什么單一轉錄本可以獲得多種編碼蛋白�！�

 

 

生物通往期文章
1. Nature子刊：單分子測序揭示鸚鵡模仿能力
2. PacBio RS第三代單分子測序系統全球訪談紀要（一）
3. 單分子測序技術助力歐洲大腸桿菌研究
4. 單分子測序解決“極端”基因組組裝難題
5. 單分子測序輕松升級參考基因組

• PacBio系統適用的混合拼接和獨立組裝軟件介紹

Mark Chaisson：
 
“考慮到PacBio的超長讀長和隨機誤差的特性，之前基于二代短讀長設計的比對算法未必能從容應對，不是不準就是太慢，所以我們必須開發出一套自己的能應用于DNA組裝的軟件�！�BLASR就是這樣應運而生的，它將是單分子測序長讀長比對的標準，特別針對PacBio的超長讀長和主要因插入缺失導致的隨機誤差糾錯。“我們的要求很簡單，就是既快又準。”我們將BLASR跟現有的經典二代組裝軟件進行了比較和相互借鑒，比如BWA-SW。相比BWA-SW，在比對48X覆蓋度的大腸桿菌數據庫時，BLASR在處理速度上有了95%的提升，錯配的區域很少；在比對覆蓋度較少的人類基因組數據庫時，BLASR的處理速度也有了成倍的改善。未來，BLASR將進一步和Celera和ALLORA等組裝軟件進行整合。

注: 詳情請見參考文獻3、參考影像4/7/13。

Adam English：

“我們專門開發了高度自動化的工具PBJelly，能夠將PacBio長片段與基因組草圖進行比對，填補或減少草圖中的缺口，從而完善基因組草圖�！�比如在果蠅基因組中，利用24X覆蓋度的PacBio數據填補了69%的殘留Gap；在虎皮鸚鵡基因組中，利用4X覆蓋度的PacBio數據填補了32%的殘留Gap；在白眉猴基因組中，利用6.8X覆蓋度的PacBio數據填補了66%的殘留Gap。后續我們用Sanger測序法進行了準確性驗證。“當你糾結于手頭PacBio數據的覆蓋度不夠高時，PBJelly也許能給你意向不到的拼接效果。”

注: 詳情請見參考文獻4、參考影像1/8、生物通往期文章2/5。

Edwin Hauw：
 PacBio現在有一系列的軟件算法可供選擇，比如AHA 、ALLORA、ALLPATHS-LG、Celera Assembler、MIRA等。其中AHA更適合搭建基因組草圖框架，其余幾個程序更適合混合拼接，ALLORA還可以用來做de novo組裝，但需要配合P_ErrorCorrection手工糾錯。除此之外，我們還在和其他研究機構合作開發一些優化的軟件算法，用于不同的場合。比如新開發的LSC長讀長糾錯法，在轉錄組和RNA測序方面就比pacBioToCA更加優異。當然也有其他機構在自行開發適合于自身應用的軟件，比如Baylor醫學院開發的PBJelly軟件等。

“我想說，不同物種的基因組復雜程度千差萬別，因此沒有一個算法是萬能的，懂得選擇很重要�！�比如，當PacBio數據覆蓋度很高時，Celera Assembler和ALLORA是最佳混合拼接解決方案；當覆蓋度不高時，可以考慮AHA或者PBJelly，這兩個比較適合于基因組草圖升級工作。相比較只能處理200M基因組的AHA，PBJelly的優勢在于可以應付G級基因組。即使有些場合可以通用，但AHA勝在既可連接Contig也可填補Gap，而PBJelly則勝在精細填補Gap的能力上，它不會去連接Contig。

注: 詳情請見參考文獻3、參考影像4/7/13。

Jonas Korlach：
 盡管目前業內人士對二代和三代數據混合使用的方式很感興趣，但事實上我們正想方設法去避免類似的事情發生。“技術正在不斷變革，我們不認為這種方法（指混合糾錯或混合拼接）在以后還將是所謂的典范。我們已經在拼接算法開發上取得了很大進展，只用PacBio自身的數據進行層次組裝（Hierarchical Genome Assembly Process，HGAp），即以相對較長的讀長數據為種子（Seeding Reads），以相對較短的讀長數據用于內部糾錯。這個時候得到的讀長數據足夠長也足夠準確，完全可以用于獨立的de novo組裝，而無需二代數據幫忙�！�HGAp的出現意味著可以不依賴于二代測序數據進行混合拼接，也可以不依賴于PacBio的CCS環形比對模式糾錯，只需要通過PacBio的CLR連續長讀長模式就可以進行獨立糾錯和拼接，最終結果“在20X覆蓋度下的正確率超過99.999%（QV54.5）”，而SMRT Cell的消耗量卻只有之前的50%。目前HGAp已經發布到DevNet上。我們同期還開發了改良版的一致序列算法稱之為Quiver，也發布到網上共享，該算法內嵌了Markov模型，在Base Calling設置上可以進一步降低一致序列的生成錯誤率。我們建議把HGAp用在基因組組裝和拼接上，把Quiver用在最終的基因組打磨（Polishing）工作，用組合的方式在精確度上進行Doublecheck。

Michael Schatz：

長度長測序“完全有能力”解析諸如人類基因組等復雜基因組�！霸谖恼轮形覀冇肞acBio的長讀長數據改善了1.2 Gb鸚鵡基因組的de novo組裝，現在我們又開始嘗試對幾種水稻和線蟲進行de novo測序。在不久的將來，我們計劃只通過長讀長法（HGAp）對人類和小麥基因組進行獨立測序并組裝。隨著PacBio讀長和通量的不斷改善，我希望我們還能看到更多的應用。光去年一年，PacBio將讀長和通量提升了3-4倍，而且根據他們的Roadmap這個趨勢還將繼續到下一年。”

注: 詳情請見參考文獻2、參考影像7/10/11/12、生物通往期文章1/2。

歡迎了解PacBio RS系統的更多信息

參考文獻

1. Finished bacterial genomes from shotgun sequence data. Ribeiro FJ, Przybylski D, Yin S, Sharpe T, Gnerre S, Abouelleil A, Berlin AM, Montmayeur A, Shea TP, Walker BJ, Young SK, Russ C, Nusbaum C, Maccallum I, Jaffe DB. Genome Res. 2012 Nov;22(11):2270-7.
http://genome.cshlp.org/content/22/11/2270.long

2. Hybrid error correction and de novo assembly of single-molecule sequencing reads. Koren S, Schatz MC, Walenz BP, Martin J, Howard JT, Ganapathy G, Wang Z, Rasko DA, McCombie WR, Jarvis ED, Adam M Phillippy. Nat Biotechnol. 2012 Jul 1;30(7):693-700.
http://www.nature.com/nbt/journal/v30/n7/full/nbt.2280.html

3. Mapping single molecule sequencing reads using Basic Local Alignment with Successive Refinement (BLASR): Theory and Application. Chaisson MJ, Tesler G. BMC Bioinformatics. 2012 Sep 19;13(1):238.
http://www.biomedcentral.com/1471-2105/13/238

4. Mind the Gap: Upgrading Genomes with Pacific Biosciences RS Long-Read Sequencing Technology. English AC, Richards S, Han Y, Wang M, Vee V, Qu J, Qin X, Muzny DM, Reid JG, Worley KC, Gibbs RA. PLoS One. 2012;7(11):e47768.
http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0047768)

5. Origins of the E. coli strain causing an outbreak of hemolytic-uremic syndrome in Germany. Rasko DA, Webster DR, Sahl JW, Bashir A, Boisen N, Scheutz F, Paxinos EE, Sebra R, Chin CS, Iliopoulos D, Klammer A, Peluso P, Lee L, Kislyuk AO, Bullard J, Kasarskis A, Wang S, Eid J, Rank D, Redman JC, Steyert SR, Frimodt-Møller J, Struve C, Petersen AM, Krogfelt KA, Nataro JP, Schadt EE, Waldor MK. N Engl J Med. 2011 Aug 25;365(8):709-17.
http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1106920

6. Pacific biosciences sequencing technology for genotyping and variation discovery in human data. Carneiro MO, Russ C, Ross MG, Gabriel SB, Nusbaum C, DePristo MA. BMC Genomics. 2012 Aug 5;13:375.
http://www.biomedcentral.com/1471-2164/13/375

7. The origin of the Haitian cholera outbreak strain. Chin CS, Sorenson J, Harris JB, Robins WP, Charles RC, Jean-Charles RR, Bullard J, Webster DR, Kasarskis A, Peluso P, Paxinos EE, Yamaichi Y, Calderwood SB, Mekalanos JJ, Schadt EE, Waldor MK. N Engl J Med. 2011 Jan 6;364(1):33-42.
http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1012928

參考影像
1. PacBio AGBT 2012 English
2. PacBio AGBT 2012 Mason
3. PacBio AGBT 2012 Testimonial Mason
4. Virtual Poster: De Novo Microbial Sequencing with Hybrid PacBio Genome Assemblies, Lawrence Hon (Pacific Biosciences)
5. Virtual Poster: Hybrid Assembly of a Nocturnal Lemur, Chris Mason (Weill Cornell Medical College)
6. Virtual Poster: Hybrid Assembly of Novel Bacterial Genomes, Ali Bashir (Mt. Sinai)
7. Virtual Poster: Understanding Single Molecule Accuracy, John Eid (Pacific Biosciences)
8. Virtual Poster: Upgrading Reference Genomes with PacBio Long Read Sequencing, Adam English (Baylor)
9. Webinar: Applications of SMRT® Technology to Livestock Research, Timothy Smith (USDA)
10. Webinar: De-Novo Assembly of a Vertebrate Genome using PacBio Hybrids with Other Sequencing Technologies, Erich Jarvis (Duke University)
11. Webinar: Error Correction and De Novo Assembly of Complex Genomes, Mike Schatz (CSHL).
12. Webinar: Hybrid Error Correction and De Novo Assembly of Single-Molecule Sequencing Reads, Adam Phillippy & Sergey Koren (NBACC)
13. Webinar: Revealing the Genome through SMRT Biology, Kerstin Stangier (GATC Biotech)

生物通往期文章
1. Nature子刊：單分子測序揭示鸚鵡模仿能力
2. PacBio RS第三代單分子測序系統全球訪談紀要（一）
3. 單分子測序技術助力歐洲大腸桿菌研究
4. 單分子測序解決“極端”基因組組裝難題
5. 單分子測序輕松升級參考基因組