主題三：實現對堿基修飾進行直接測序的意義所在？

• 堿基修飾直接測序法的經典案例

Matthew Waldor：

我們比較好奇到底是什么賦予E. coli O104:H4這么與眾不同的高致病性，直到我們發現這個菌株有很多基因的甲基化形式與其他菌株不同。我們最初發現該菌株中有個噬菌體插入片段，上面有編碼甲基化相關的基因序列。“我們對此有些疑惑，這個噬菌體引入的甲基化系統是否會影響菌株的甲基化譜，從而進一步影響菌株的致病性。”

甲基化在細菌基因表達和致病性影響中發揮的作用業界已有很多共識，但我們一直對其基因組的全甲基化譜知之甚少。PacBio的單分子實時測序功能很對我們的胃口。“利用PacBio技術，你可以通過監測DNA合成得到堿基序列信息，同時，你還額外得到了每個堿基如何摻入的動力學信息。”我們用PacBio對E.coli O104:H4菌株進行了“前所未有的全基因組甲基化譜分析”，共發現了50,000多個甲基化位點。不僅是甲基化位點，我們還發現了11個直接參加菌株甲基化修飾的酶，其中有7個甲基化轉移酶之前從未研究過。更令人震驚的是，噬菌體引入的甲基化系統使該菌株1/3以上的基因表達水平發生了改變。“這真是一個爆炸性的發現，沒想到基因組上一個小小病毒的插入片段會引起轉錄水平上如此波瀾壯闊的全局效應。”這些轉錄水平變化顯著提高了菌株的生長繁殖和運動能力，從而側面促進了致病性。感謝PacBio單分子實時測序技術最終為我們答疑解惑。“這就相當于擁有了一個全新的顯微系統，能把之前無法看到的變得一覽無余。它必將在微生物領域催生出更多更新的DNA修飾研究方向，在我們能想到的不久的將來，還會廣泛應用到其他物種領域中去。”

注: 詳情請見參考文獻2/3、參考影像4、生物通往期文章1/2/5。

 

Eric Schadt：

DNA序列本身不足以說明疫情爆發菌株異乎尋常的高致病性。“相同的血清型，為什么疫情爆發菌株的致病性就這么強？要想徹底解決這個問題，如果你不能全局性地分析任何確定已經發生的變異，那么你只會離答案漸行漸遠。”于是我們想對堿基修飾進行一輪全基因組范圍的掃描，尤其是甲基化修飾。因為近十年來已有大量報道，認為甲基化在微生物致病過程中所發揮的功能舉足輕重。

其他任何的測序儀完全不可能直接分析這些表觀遺傳學標記，因為它們在測序前需要PCR擴增，一擴增這些修飾標記就被置換而消失殆盡了。但PacBio的單分子實時測序（SMRT）法可以辦到，利用DNA聚合酶的動力學特征，堿基摻入時產生的停頓間隔脈沖信號足夠敏感，足夠區分12種以上不同類型的堿基修飾。堿基修飾譜分析是PacBio測序數據中的固有部分，你所需要的只是把之前的測序數據重新調出來，再找些種合適的軟件分析即可。“通過這種方式我們發現了一些跟菌株致病性相關的堿基修飾，這是全新的發現，因為之前人們根本無法想象也從沒見過。”

在一天之內實現de novo測序同時進行全基因組甲基化譜分析是微生物研究領域向精細功能分析邁進的重大變革。“把測序獲得的A、G、C、T信息整合成完整基因組圖譜是一個工程浩大的拼圖游戲，長讀長在其中無疑體現了無可替代的重要性。但千萬別忘了，序列上的堿基還可以被化學修飾，通過堿基修飾可以操縱特定蛋白和特定序列的結合，從而實現重大的功能改變。如果光有序列信息，而沒有堿基修飾信息，你就是無法看到變異或表型多樣性的全部及淵源。如果當時我們沒有查看堿基修飾，我們就錯過了深入了解致病菌進化歷程和完整繪制其基因組圖譜的機會。”

“生物網絡的復雜性體現在遺傳信息不僅僅體現在DNA序列組成上，表觀遺傳學可以說是當今疾病研究中最激動人心、發展最為蓬勃的領域。PacBio的全基因組甲基化譜分析能力和高度重復區域直接測序能力將極大推動表觀遺傳學在人類健康事業中的研究進程，同時還可以有效縮減項目花銷。”

注: 詳情請見參考文獻2/3、參考影像4、生物通往期文章1/2/5。

 

• 堿基修飾直接測序法的原理

Stephen Turner：

“現行的方法，表觀遺傳學和基因組學研究是截然分開的。沒人會通過研究亞硫酸氫鹽處理過的樣品（表觀遺傳學方法）而聲稱從中得出了基因組學研究的重大進展，事實上我們在這個傳統方法中已經丟失了胞嘧啶所應該包含的其他信息。”有別于二代測序，PacBio RS系統實時觀察DNA的合成過程并記錄熒光標記的堿基摻入信息，它不需要擴增，而不擴增恰恰可以保留表觀遺傳信息。PacBio的獨特之處還在于，它不需要進行亞硫酸氫鹽轉化等額外實驗步驟，聚合酶動力學的測定不會對DNA一級序列產生任何不良影響，最后你甚至可以放棄HPLC、質譜，因為它們實在太慢了。PacBio RS系統可以在測序的同時檢測表觀遺傳學修飾，從而把表觀遺傳學和基因組學研究有機整合在一起。

事實上，在開發PacBio單分子實時測序技術的最早期，我們就考慮過把PacBio逐漸引向解讀DNA修飾的方向。當堿基有額外修飾時，DNA聚合酶的合成速度會減慢，對應的信號會被檢測出來。“這就好比是開車經過減速帶，一個凸起的路障會干擾車速。每種堿基修飾事件都會使聚合酶的‘停頓模式’產生微小差異，最終反映到熒光脈沖信號的間隔上。” 畢竟PacBio的光學系統是頂尖的，只要我們捕捉得到，我們就有分析并把它們區分開的可能，實時檢測的特點將賦予研究人員解讀任何一種堿基修飾的可能性。

PacBio給出的還不僅僅是堿基修飾的一維信號，由于DNA聚合酶會接觸11個堿基，所以相當于這11個位置的堿基摻入速度和節律都會被記錄下來。或者說，堿基修飾對聚合酶動力學的影響并不僅僅停留在自身，脈沖信號之間的間隔往往還與修飾堿基的上下游相關，這里面似乎還有其他暗示。“如果沒有SMRT技術，這些現象就會一直被忽略了。”

我們一般推薦采用25-250X的測序深度檢測甲基化修飾，在目前容忍5%假陽性率的情況下，準確率可以達到90%以上。我們還會繼續優化，在不影響準確率的基礎上將所需的測序深度降下來（比如使用富集法可以使覆蓋度降至5X）。

除了甲基化，我們還嘗試直接檢測其他DNA修飾，比如在一些DNA損傷的場合。我們現在可以直接在DNA單分子上檢測5-hC、5-hmU、5-hU、1-mA、6-mA、8-oxoA、BPDE、6-mT、6-mG等堿基修飾。對于一些非常新穎的堿基修飾檢測，我們目前還需要通過人工根據經驗和設置對照進行比對和判定，不久的將來，我們會優化出算法，用軟件直接讀出來。

注: 詳情請見參考文獻1/2、參考影像1/2、生物通往期文章1/2/3/4。

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• 直接測序法分析甲基化組學（Methylome）的先行者

Richard Roberts：
 
翻譯后修飾研究持續升溫，尤其是甲基化研究。在哺乳動物中，研究熱點從5-mC一直延續到5-hmC、5-fC和5-caC。甲基化在細菌基因組中也很常見，它們作為限制修飾系統的一部分，保護宿主不受其他限制性內切酶的傷害。“我們對在細菌基因組中發現新穎甲基化的工作非常感興趣。甲基化修飾現在認為非常普遍，但之前因缺乏定位這些甲基化的簡單方法，它們常常就被忽略了，直到PacBio單分子測序技術的出現。”

我們公司正在研究一類比較特別的限制性內切酶，這類酶的識別序列包含甲基化信息，但又不能通過傳統的方法發現識別序列，因為識別基本上是隨機的。“這個操作起來很難，往往需要幾個月才能找出清晰的識別序列，不光費時而且費力，我們非常不情愿這樣做。”所以唯一解決的辦法是直接測序分析甲基化位點。“通過與PacBio合作完成的全基因組甲基化譜分析，我們可以找到甲基化酶的識別序列，無論是什么甲基化酶，只要它在那。”

我們用PacBio RS系統對6種細菌基因組進行了重測序，不僅鑒定出細菌基因組中新的胞嘧啶和腺嘌呤甲基化位點，還鑒定出介導這些表觀遺傳學標志的甲基轉移酶。“這真是我們首次有能力對細菌基因組進行全方位的甲基化組學分析，也只有PacBio RS系統才能讓我們這樣干！”也許你可能認為通過計算法進行甲基轉移酶位點預測的方法也行得通，但并不是所有甲基轉移酶都可以這樣做，如果有一類甲基轉移酶稍有變構，其識別Motif就會發生改變。

目前我們的合作主要在6-mA和4-mC修飾，我們還在開發5-mC修飾評估的方法學，這個信號相對比之前兩個要弱，我們已經有所進展，并準備買一臺PacBio今后獨立開發后續的其他修飾評估法。

注: 詳情請見參考文獻6、生物通往期文章3/6/8。

 

Jonas Korlach：

“NEB跟我們說，想要做一件創造歷史的事情，即對細菌的基因組進行完整的甲基化修飾譜分析，因為之前沒有哪家這樣干過。這個想法很吸引人，于是我們一拍即合。”

我們的研究人員對NEB提供的6種細菌基因組進行了重測序。這些細菌之前也在其他平臺上測序過，但這次是利用PacBio RS系統專門來解讀甲基化信號。他們之前將某個甲基化轉移酶基因克隆到質粒上，并在甲基化缺陷型大腸桿菌菌株中增殖，配合他們的計算預測方法來尋找并分析其識別位點。然而，這套方法沒有達到理想效果。“因此，我們決定用PacBio單分子測序方法直接分析細菌的甲基化組學，以便獲得甲基化程度的準確評估。”通過單分子測序，我們在細菌基因組中發現了多個新的6-mA和4-mC修飾，并指定了負責那些甲基化模式的甲基轉移酶。

注: 詳情請見參考文獻6、生物通往期文章3/6/8。

 

• 化學標記富集法推動堿基修飾直接測序

Donncha Dunican：

5-mC和5-hmC的結構非常類似，用傳統的發現5-mC的方法（如限制性內切酶法和亞硫酸氫鹽測序法）不能很好的區分出5-hmC。“我們對5-hmC修飾非常好奇，這個修飾研究以后必定會大熱，但前提是必須找到一個合適的方法有效地鑒定出來。NIH等機構花巨資以期在大量不同的人類樣本中用表觀基因組測序法發現并區分5-mC和5-hmC，但后來發現傳統的測序法根本就是徒勞。”其結果是，早期發現的那些甲基化譜數據必須要經過新一輪的重新分析，以便從中挖掘出被淹沒的5-hmC。“揭示5-hmC的存在和功能是表觀遺傳學研究領域的一個嚴峻挑戰，我們為此不得不開發出一個更為行之有效的測序化學配方。”

 

Suneet Agarwal：

我們開發了兩種方法來捕獲富集羥甲基化修飾。一種方法是用亞硫酸氫鹽法將hmC轉變為CMS，再用CMS抗體把hmC分子捕獲下來。另一種方法是先用噬菌體酶在hmC上加上葡萄糖，然后通過化學反應把糖分子轉變為功能醛基，再通過醛基在hmC上連接生物素，從而最終可以通過生物素-鏈霉親和素反應把hmC分子捕獲下來（第二種方法與Chuan He開發的方法非常類似。）“但這些方法只是說明了有5-hmC，但并沒有說明在哪。所以我們迫切希望能把這些方法和其他技術結合起來，那個技術需要能提供實時單分子測序的能力。”

 

Jonas Korlach：

“這些定向富集的策略也可以與二代測序法通用，但是，如果你不能拿到單堿基分子水平的分辨率，你就無法得到真正的測序結果和修飾信息。”

 

 

 

Chuan He：

很多研究人員還在用亞硫酸氫鹽測序法研究甲基化修飾，但這種方法無法區分出羥甲基化修飾。“但在PacBio系統上，羥甲基化測序和甲基化測序可以統一起來，運行一次就可以同時分析兩種修飾。”

盡管利用第三代單分子測序法可以區分5-mC和5-hmC，但需要大約250X的覆蓋度才能檢測到5-hmC。“我們就是想把5-hmC的檢測變得敏感些，最容易想到的是，加個標簽以便富集信號。”我們對5-hmC進行了選擇性化學標記，在引入疊氮修飾的基礎上反應安裝上一個生物素標簽。通過這種方法就可以富集基因組中的5-hmC，減少所需的測序量。我們把5-hmC的化學標記富集法和PacBio的單分子測序技術結合起來，可以實現在單堿基水平檢測疾病發生發展相關的表觀遺傳標志。化學修飾富集法使DNA聚合酶在堿基修飾處的停頓延長，使檢測成為可能。“停頓時間與不處理狀態時比較延長了10-20倍，這樣你就可以信心滿滿地下結論，這兒確實存在5-hmC修飾。”

這套方法分別在已知的合成DNA片段和小鼠胚胎干細胞樣品中得到了驗證。在檢測小鼠胚胎干細胞中的堿基修飾時，我們還能清楚地區分5-hmC發生在DNA哪條鏈上。這種修飾在小鼠發育中作用明顯，在小鼠成體中修飾程度提高了4-5倍，在其他諸如與神經退行性疾病、低氧、血管生成等相關的基因上也發現了5-hmC修飾。“我們目前并不知道5-hmC修飾在這些疾病相關基因上的具體功能，但可以肯定這里面有聯系。”

我們把化學標記富集法的使用許可權交給了Active Motif公司，他們開發出了試劑盒（Hydroxymethyl Collector Kit）。通過這個試劑盒，不光可以檢測出羥甲基化修飾，還可以顯著降低檢測覆蓋度。比如PacBio推薦5-hmC檢測需要250X 覆蓋度，但使用試劑盒后覆蓋度可以降低至只要5X 覆蓋度。我們還在結合PacBio平臺開發其他甲基化修飾的化學標記富集法，主要還是想把檢測覆蓋度不斷降下來。

注: 詳情請見參考文獻5、生物通往期文章3/7。

 

Stephen Turner：

定向富集法可以放大5-hmC堿基修飾的檢測信號，經過富集后，修飾堿基變得更大，但卻不影響DNA聚合酶對它的摻入合成，最終在較低覆蓋度下就能真實解析5-hmC修飾。“修飾堿基產生的動力學信號很強，僅需一個分子就足以檢測它的堿基修飾類型。這個結果是空前的。”

“5-hmC的發現不是終點，而只是個起點。僅由四個堿基組成DNA的說法也將不復存在。”

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• 堿基修飾直接測序法適用軟件和其他應用案例

Kevin Corcoran：

“我們很高興為測序界提供第一款也是目前唯一一款堿基修飾直接檢測工具，讓研究人員能夠把檢測堿基修飾作為測序流程中不可缺少的一部分。這是PacBio的一個里程碑，也是科學界一個寶貴的新工具。”

 

 

 

Edwin Hauw：

我們此次推出的新軟件能夠讓科研人員輕松檢測并查看這些DNA修飾。軟件通過測定DNA堿基摻入的速率而發揮作用，該信息在測序過程中自動收集。“這是PacBio單分子實時測序的一個獨到之處。”

PacBio的用戶現在可以使用這套軟件在微生物和致病菌中研究甲基化及其它表觀遺傳學事件，我們在網站上還有研究細菌甲基化組的指引。目前軟件可以自動識別5-mC、4-mC、6-mA、6-hmA等堿基修飾，其它堿基修飾可參照相關文獻通過設立對照進行檢測。我們還將對軟件不斷進行升級，2013年陸續推出其他各種堿基修飾類型。

 

 

Jonas Korlach：

最近PacBio為微生物甲基化譜分析提供了一個堿基修飾鑒定工具包，除此之外，PacBio還為準確鑒定修飾類型給出了建設性意見，比如提供堿基特定修飾對應的二級峰型圖。PacBio長讀長的特點“最終將允許表觀遺傳分型”，會幫助研究人員更好地理解諸如染色體失活和遺傳印記等表觀現象，同時可以針對相應疾病的發生發展進行更精細的表觀遺傳譜圖分析。

 

 

Robert Mandrell：

“甲基化譜分析可以讓我們有效區分不同菌株對人類宿主的致病性影響。”通過與PacBio合作，我們對導致2007年比利時冰淇淋大腸桿菌疫情和2010年美國亞利桑那生菜大腸桿菌疫情的爆發株進行了研究，目的是揭示了致病菌的基因組多樣性和毒力演化。最初我們只是想借助PacBio的長讀長數據進行基因組拼接，事實上長讀長也確實顯著降低了Contig數。“但同時我們還在PacBio的建議下觀察了堿基修飾，最終發現了亞利桑那疫情爆發株中有一段不同尋常的甲基化轉移酶編碼基因序列。這個甲基化轉移酶并不是個新穎的酶，但它出現在大腸桿菌中就顯得有些不同尋常了。”我們會和位于美國內布拉斯加州的另一個USDA ARS中心合作，繼續使用PacBio在其他各種爆發菌種中進行全基因組范圍的堿基修飾分析。

 

Rex Malmstrom：

JGI正在用PacBio技術在微生物中進行甲基化譜分析，這些微生物均與生物能源、生物處理、及食物傳播性疾病或家畜傳染病致病原等領域休息相關。“PacBio系統特別適合于檢測5-mC之外的堿基修飾，比如在微生物中6-mA修飾非常普遍，但這種修飾就無法通過傳統的亞硫酸氫鹽測序檢測。我們正在用PacBio對微生物進行全基因組范圍內的6-mA分析。”

 

 

Lucy Shapiro：
 
“隨著全球人口數量、生態學、人類和動物遷徙活動等的劇烈變化，人們對致病性細菌和病毒的認識需要不斷重視并加深，這個趨勢刻不容緩，而探索發現微生物的發育和致病機制則是重中之重。PacBio技術為細菌和病毒等的研究打開了一扇全新的大門，它提供了發掘以往無法想象并觸及的現象的機會，比如微生物發育和全基因組甲基化的關聯。同時，我本人也非常榮幸能成為PacBio公司董事會的成員，并為公司的繼續開拓進取盡綿薄之力。”

注: 詳情請見參考影像3。

 

 

 

 

 

Christopher Mason：

PacBio在微生物上的堿基修飾分析結果令我們備受鼓舞。“我們已經迫不及待地開始在哺乳動物中嘗試了。我們的最終目標是希望只通過1-2X覆蓋的聚合酶動力學數據就可以得出在哪發生了堿基修飾，以及告訴我們是何種修飾。”

 

 

 

Stephen Turner：

不僅在DNA，我們還在RNA上進行實驗，不光給RNA直接測序，還要給RNA判讀修飾，因為RNA上含有更多類型的堿基修飾。“我們一直期望SMRT技術可以不斷給基因組學和表觀遺傳學領域帶來革新。”

目前擁有兩臺PacBio RS儀器的美國能源部聯合基因組研究所JGI正在使用我們新推出的軟件在細菌中進行堿基修飾分析。有消息稱，孟山都公司也打算在擬南芥基因組中進行甲基化分析。今后這樣的應用例子將會越來越多。

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參考文獻
1. Direct detection and sequencing of damaged DNA bases. Clark TA, Spittle KE, Turner SW, Korlach J. Genome Integr. 2011 Dec 20;2:10.
http://www.genomeintegrity.com/content/2/1/10
2. Direct detection of DNA methylation during single-molecule, real-time sequencing. Flusberg BA, Webster DR, Lee JH, Travers KJ, Olivares EC, Clark TA, Korlach J, Turner SW. Nat Methods. 2010 Jun;7(6):461-5.
http://www.nature.com/nmeth/journal/v7/n6/full/nmeth.1459.html
3. Genome-wide mapping of methylated adenine residues in pathogenic Escherichia coli using single-molecule real-time sequencing. Fang G, Munera D, Friedman DI, Mandlik A, Chao MC, Banerjee O, Feng Z, Losic B, Mahajan MC, Jabado OJ, Deikus G, Clark TA, Luong K, Murray IA, Davis BM, Keren-Paz A, Chess A, Roberts RJ, Korlach J, Turner SW, Kumar V, Waldor MK, Schadt EE. Nat Biotechnol. 2012 Dec 7;30(12):1232-9.
http://www.nature.com/nbt/journal/v30/n12/full/nbt.2432.html
4. Origins of the E. coli strain causing an outbreak of hemolytic-uremic syndrome in Germany. Rasko DA, Webster DR, Sahl JW, Bashir A, Boisen N, Scheutz F, Paxinos EE, Sebra R, Chin CS, Iliopoulos D, Klammer A, Peluso P, Lee L, Kislyuk AO, Bullard J, Kasarskis A, Wang S, Eid J, Rank D, Redman JC, Steyert SR, Frimodt-Møller J, Struve C, Petersen AM, Krogfelt KA, Nataro JP, Schadt EE, Waldor MK. N Engl J Med. 2011 Aug 25;365(8):709-17.
http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1106920
5. Sensitive and specific single-molecule sequencing of 5-hydroxymethylcytosine. Song CX, Clark TA, Lu XY, Kislyuk A, Dai Q, Turner SW, He C, Korlach J. Nat Methods. 2011 Nov 20;9(1):75-7.
http://www.nature.com/nmeth/journal/v9/n1/full/nmeth.1779.html
6. The methylomes of six bacteria. Murray IA, Clark TA, Morgan RD, Boitano M, Anton BP, Luong K, Fomenkov A, Turner SW, Korlach J,Roberts RJ. Nucleic Acids Res. 2012 Dec 1;40(22):11450-62.
http://nar.oxfordjournals.org/content/40/22/11450.long

參考影像
1. Virtual Poster - Detecting Base Modifications with SMRT Sequencing, Jonas Korlach (Pacific Biosciences)
2. Virtual Poster - Detection of Damaged DNA Bases Using SMRT Sequencing, Tyson Clark (Pacific Biosciences)
3. Webinar - Dynamic Chromosome Methylation Controls Cell Cycle Progression, Lucy Shapiro (Stanford University)
4. Webinar - The Role of Adenine Methylation in Determining the Pathogenicity of a Bacteria, Eric Schadt (Mt. Sinai School of Medicine)

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