Broad 研究院的科學(xué)家們利用PacBio RS系統(tǒng)對(duì)千人基因組計(jì)劃中產(chǎn)生的SNP突變進(jìn)行基因分型與驗(yàn)證，探討了PacBio 單分子測(cè)序技術(shù)在該領(lǐng)域的應(yīng)用，相關(guān)的文章于8月5號(hào)在線發(fā)表在《BMC Genomics》上。

長(zhǎng)期以來(lái)，二代測(cè)序因?yàn)槠�段過(guò)短，而容易產(chǎn)生各種假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果，所以對(duì)于基因組測(cè)序所產(chǎn)生的突變數(shù)據(jù)一般需要利用其他方法進(jìn)行交叉驗(yàn)證，以找到真正的突變；目前研究人員對(duì)于突變數(shù)據(jù)的驗(yàn)證一般采用Sequenom質(zhì)譜、Sanger測(cè)序法。雖然這兩種方法的準(zhǔn)確性很高，能檢出大量的假陽(yáng)性與假陰性結(jié)果，但是Sequenom方法對(duì)未知位點(diǎn)突變無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)，且很多分析仍然需要借助人工方法，容易產(chǎn)生人工誤差。而Sanger測(cè)序法通量低、花費(fèi)大且同樣存在人工誤差的問(wèn)題。此外采用多種測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行交叉驗(yàn)證也大大降低了效率，且產(chǎn)生新的突變類型導(dǎo)致更加復(fù)雜的分析。所以，*好是利用已有的測(cè)序平臺(tái)直接產(chǎn)生高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)，*大程度避免其他方法的交叉驗(yàn)證，大大提高研究效率。

PacBio 單分子測(cè)序技術(shù)能產(chǎn)生大量的長(zhǎng)片段數(shù)據(jù)，能更好的進(jìn)行基因組定位，而且能迅速的進(jìn)行基因組組裝，其CCS測(cè)序模式能產(chǎn)生比二代測(cè)序技術(shù)更準(zhǔn)確的序列數(shù)據(jù)，對(duì)單分子的直接測(cè)序也能*真實(shí)的反應(yīng)原始序列信息，所有的這些特性為PacBio單分子測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分型與驗(yàn)證方面提供了良好的條件。

Broad 研究院的科學(xué)家們從千人基因組計(jì)劃產(chǎn)生的SNP數(shù)據(jù)中挑選了98個(gè)已經(jīng)用其他方法驗(yàn)證過(guò)的難測(cè)SNP位點(diǎn)（其中38個(gè)是真實(shí)位點(diǎn)，60個(gè)是假結(jié)果），分別利用PacBio平臺(tái)和Illumina Miseq平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，PacBio數(shù)據(jù)有著更好的準(zhǔn)確性和假陽(yáng)性檢出率，相對(duì)而言是一種更為有效的驗(yàn)證工具。研究人員也利用這兩個(gè)平臺(tái)分別對(duì)Hap map中的225個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證分析，也顯示PacBio平臺(tái)能更有效的發(fā)現(xiàn)新的變異，修正參考基因組，研究人員認(rèn)為PacBio技術(shù)是一種有效的后期驗(yàn)證與重復(fù)實(shí)驗(yàn)的工具。

因?yàn)闃O端的堿基序列組成是許多測(cè)序數(shù)據(jù)錯(cuò)誤產(chǎn)生的源頭,二代測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的大多是短序列數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)在進(jìn)行基因組定位時(shí)更容易發(fā)生定位錯(cuò)誤，而且依賴PCR過(guò)程，不可避免有擴(kuò)增錯(cuò)誤，這些錯(cuò)誤是系統(tǒng)性的，很難糾正，使得測(cè)序結(jié)果錯(cuò)誤率較高；而PacBio單分子測(cè)序產(chǎn)生的是長(zhǎng)片段，能更精準(zhǔn)的進(jìn)行定位，*大限度的降低定位錯(cuò)誤，不引入PCR bias，其測(cè)序產(chǎn)生的錯(cuò)誤都是隨機(jī)錯(cuò)誤，不隨片段的延長(zhǎng)而增加，可以通過(guò)GATK軟件進(jìn)行糾正，所以PacBio平臺(tái)能有著更好的基因分型與突變驗(yàn)證應(yīng)用。

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Pacific biosciences sequencing technology for genotyping and variation discovery in human data

Mauricio O Carneiro ，Carsten Russ，Michael G Ross ，Stacey Gabriel，Chad Nusbaum ，Mark A DePristo

BMC Genomics 2012, 13:375      doi:10.1186/1471-2164-13-375

Abstract

Background

Pacific  Biosciences  technology  provides  a  fundamentally  new  data  type  that  provides  the potential  to  overcome  some  limitations  of  current  next  generation  sequencing  platforms  by providing significantly longer reads, single molecule sequencing, low composition bias and an error profile that is orthogonal to other platforms. With these potential advantages in mind, we  here  evaluate  the  utility  of  the  Pacific  Biosciences  RS  platform  for  human  medical amplicon resequencing projects.

Results

We evaluated the Pacific Biosciences technology for SNP discovery in medical resequencing projects  using  the  Genome  Analysis  Toolkit,  observing  high  sensitivity  and  specificity  for calling  differences  in  amplicons  containing  known  true  or  false  SNPs.  We  assessed  data quality: most errors were indels (~14 %) with few apparent miscalls (~1 %). In this work, we define  a  custom  data  processing  pipeline  for  Pacific  Biosciences  data  for  human  data analysis.

Conclusion

Critically,  the  error  properties  were  largely  free  of  the  context-specific  effects  that  affect other sequencing technologies. These data show excellent utility for follow-up validation and extension studies in human data and medical genetics projects, but can be extended to other organisms with a reference genome.