生物通報道 美國加州大學戴維斯分校（UC Davis）醫學院及Pacific Biosciences公司的研究人員利用單分子實時測序技術，對脆性X綜合征的關鍵基因FMR1中的CGG片段擴增進行了測序。他們在第15屆脆性X和早發性認知缺損國際研討會上公布了他們的研究成果。

脆性X綜合征（又稱Martin-Bell綜合征）是一種遺傳性綜合征。它導致一系列特征性癥狀，包括生理、智力、情緒、以及行為上的異常。癥狀的輕重各有不同。該疾病伴隨著X染色體上一段三核苷酸序列（CGG）的擴增。這種擴增導致了一種稱為FMR1的蛋白質無法在病人體內表達，而該蛋白質是神經正常發育所必需的。

脆性X智力低下（FMR1）基因位于X染色體上，其5’非翻譯區（5’UTR）包含了CGG三核苷酸的重復序列。大部分人的CGG片段重復5-44次。CGG片段的擴增與認知力和生殖功能受損相關。如果一個人含有45-54個重復序列，則被認為是“灰色地帶”，而55-200個重復序列被稱為前突變，200個以上重復序列則被稱為全突變。

中度CGG重復序列擴增（55-200個CGG重復）可導致脆性X相關性震顫/共濟失調綜合征（FXTAS），一種以意向性震顫、步態共濟失調和其他癥狀為特征的遲發性神經變性疾病1。而高度CGG重復序列擴增（>200個CGG重復）可引起轉錄沉默和FMR1編碼蛋白（FMRP）的功能喪失，從而導致脆性X染色體綜合征1。

由于目前的測序方法都依賴于大量相同拷貝的讀取，因而大量擴增的CGG重復（>100）只能生成不連貫的信號（圖1）。這阻礙了研究人員獲得單堿基分辨率的測序數據。

圖1：隨著重復擴增數量的增多，生成大量相同的拷貝變得越來越困難。這阻礙了對大部分疾病范圍(>100次重復)內重復擴增序列的準確測序。

于是，研究人員利用Pacific Biosciences公司的單分子實時（SMRT）測序技術，試圖從大量擴增的CGG重復序列中產生高質量的測序數據（圖2）。他們首先利用PCR從人類基因組DNA中擴增出帶不同CGG重復的FMR1序列，制備出待測文庫。隨后加上發夾測序接頭，生成閉合的環狀測序模板。之后利用Pacific Biosciences RS對樣品進行測序。最后采用BLASR算法將長讀取裝配成環狀共有序列（CCS），而目標序列的覆蓋度至少為3倍。

 
結果表明，環狀共有序列的讀取產生了生理相關范圍的重復擴增。而對長的重復等位基因的測序能力似乎僅受讀長限制。原始讀長超過10 kb，使得環狀共有序列覆蓋了超過750個CGG重復片段。

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圖3：一段CGG重復片段范圍內的環狀共有序列讀取圖。接近155個重復的峰是SMRT cell被動上樣偏向（passive loading bias）與較小插入片段優勢的綜合結果。示例：環狀共有序列讀取包含372個CGG重復。

研究人員認為，通過這種方法，如今能夠以單堿基分辨率完整鑒定所有與疾病相關的等位基因，從而有利于疾病的準確診斷。（生物通 余亮）

參考文獻
1. Oostra, B.A. and R. Willemsen, FMR1: a gene with three faces. Biochim Biophys Acta, 2009. 1790(6): p. 467-77.
2. Eid, J., et al., Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science, 2009. 323(5910): p. 133-8.