主題五：前景：PacBio的未來方向以及為測序帶來的變化？

• PacBio系統的已有升級和表現效果

Jonas Korlach：

2012年第三季度，PacBio推出了Magbead自動化上樣系統。MagBead自動上樣系統可以實現僅用1微克DNA樣品構建10 Kb文庫，起始量只有之前的1/5-1/10。這個自動化系統可以用于片段純化，同時又是大片段上樣的便捷方式。用戶們也清楚，樣本準備工序一直是測序質控中的決定性因素，自動化除了省時省力外，更關鍵的是它還可以大大提高測序質量。

2012年11月初，PacBio發布了XL試劑和軟件包，可以將平均讀長延長到5000 bp。PacBio為XL試劑的使用提供了兩種選擇。一種選擇是用XL Binding Kit和C2 Sequencing Kit作一個組合。XL Binding Kit中包含的DNA聚合酶比C1和C2擁有更多的改良突變，這些改良一方面使酶的合成速率提高（3 Base/sec vs. 2.5 Base/sec），另一方面使酶對抗光損傷的能力提升。另一種選擇是同時用XL Binding Kit和XL Sequencing Kit，這種組合下平均讀長可以突破5000 bp，但缺點是正確率比第一種組合略低，我們正在優化軟件進行進一步改善。XL試劑盒同時還升級了通量。用2x55 min Movie模式每個SMRT Cell可以得到200-250 Mb數據量，用1x120 min Movie模式每個SMRT Cell可以得到160 Mb數據量，相比C2提高了一倍。

在2013年上半年，PacBio計劃提供局部硬件升級，將通量提高至每個SMRT Cell約產出500 Mb數據量。通量再次翻番的實現是通過對150000個ZMW同時進行數據采集，而非之前僅針對75000個ZMW。同時我們還在深入研究抗光損傷DNA聚合酶，這將進一步提升讀長和通量。新的試劑盒有望在2013年底上市。

相應地我們也進行了分析軟件更新，除了微生物堿基修飾自動分析軟件外，PacBio在2013年上半年發布了SMRT Analysis 1.4，并共享到DevNet上。SMRT Analysis 1.4中包含一個新的基因組層次組裝流程，稱為HGAp（Hierarchical Genome Assembly process），可以實現完全用PacBio的長讀長數據對微生物或真菌基因組進行de novo測序和組裝，不再借用混合拼接的方式。同時還包含一個新的Consensus Reading（Base Calling）算法，稱為Quiver，可以把測序準確率進一步提升至99.999%以上。

這一系列的已有更新將會悉數被加州大學 Davis分校的科研人員采納，用于對包括沙門氏菌（Salmonella）、彎曲桿菌（Campylobacter）、大腸桿菌（E. coli）、弧菌（Vibrio）和李斯特菌（Listeria）等在內的100000多種致病菌樣本進行基因組測序，也稱為100K食源性致病菌基因組項目（100K Foodborne Pathogen Genome Project，簡稱100K基因組計劃）。長讀長、高度一致的精確性、以及對GC含量或基因組序列無測序偏好，這些特點使SMRT測序技術能夠以無預先假設、無偏向性的方式構建完成基因組。

Michael Schatz：
 
在水稻基因組de novo測序項目中，我們率先嘗試了XL試劑，在得到的9X覆蓋度的長讀長數據中，有50%的讀長都超過了4800 bp。“與末端配對測序和ALLPATHS-LG組裝結果相比，XL貢獻的長讀長使Contig連續性提高了一倍。”我們之前用Illumina獲得的Contig N50值為16 Kb，但加入PacBio長讀長數據后，N50一下提升至25 Kb，按照PacBio的發展趨勢，很快就能獲得兆級大小的Contig，甚至于可以把植物染色體序列直接兌換成單條Contig。

“一開始之所以額外引入Illumina數據是因為三代長讀長數據的覆蓋度不夠，所以無法用PacBio數據進行自我組裝，不得已只能采取混合拼接的方式。不過我們正在設法使PacBio的長讀長覆蓋度翻番，寄希望于僅用自我糾錯過的長讀長數據就能實現完美的組裝方案。”我們研究組還在繼續攻關水稻基因組De novo組裝課題，在樣品準備和組裝方法優化等環節上尋找突破口。這個基因組同時還在用BAC-by-BAC和Sanger法進行測序，參考測序結果可以為長讀長組裝正確率提供評估標準。這還只是測試項目，我們的最終目的是，“用PacBio指導并改善及其龐大又復雜的小麥基因組拼接和草圖繪制工作”。

注: 詳情請見生物通往期文章1/2。

Eric Antoniou：
 
在470 Mb水稻基因組測序項目中，我們使用PacBio的MagBead上樣系統和XL試劑，發現讀長顯著增加，“即使用XL試劑下最短的讀長都要超過之前使用C2試劑下的最長讀長，而XL試劑下的最長讀長達到了26404 bp”。

注: 詳情請見生物通往期文章1/2。

J. Craig Venter：
 
“通過最近的軟件更新，PacBio RS系統可以產出超長讀長并實現超高精度的從頭組裝，這極大地改善了我們的發現能力，以便更經濟高效地獲得新型基因組信息。”

注: 詳情請見生物通往期文章1/2。

Marc Allard：

100K基因組項目是2012年由加州大學Davis分校、安捷倫公司和FDA共同發起的，旨在通過基因組測序與分析建立一個公開的致病菌遺傳學數據庫，來應對食品安全問題引發的憂慮。“為致病菌提供單一完整的基因組是至關重要的，FDA選擇PacBio RS系統就是為了能迅速實現細菌基因組圖譜的完整化。”

注: 詳情請見生物通往期文章5。

Bart Weimer：

建立諸如100K基因組計劃這樣的泛基因組測序項目的意義是十分重大的，它將有助于更好地“分析爆發源的基因構成，當疫情爆發時，我們就可以更全面地獲悉信息并作出判斷，是否分離出來的爆發菌株對應已有的疫情還是全新的疫情。

“SMRT測序技術生成的完整基因組將對這一數據庫做出寶貴的貢獻，為人們提供更多的生物學信息，幫助人們發現新的生物標記物，并為食源性致病菌檢測提供參考基因組。原因在于，微生物基因組的特點非常多變，如果沒有一個可靠的de novo從頭測序和基因組裝配的途徑，就很難檢測微生物基因組的變異，這包括結構變異以及可移動元件、噬菌體或質粒的獲取和丟失。更何況微生物基因組的變異對于食品安全又有很重要的影響，把握變異就成為選擇測序方案的首要依據。”

注: 詳情請見生物通往期文章5。

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• PacBio系統的未來升級方向

Jonas Korlach：

我們的策略基于盡可能地減少DNA聚合酶的光損傷，這是影響讀長因素中最主要的一個。目前而言，讀長主要受限于DNA聚合酶和熒光染料的間歇性相互作用。“每過一會兒，負責產生光信號的熒光染料總要和DNA聚合酶相互接觸并發生作用，光能量會順勢轉移過來‘侵蝕’DNA聚合酶，每接觸一次侵蝕一次，到某個極限值就會終止測序過程。”光侵蝕某種程度上跟距離或接觸程度相關。“所以我們的策略就是讓熒光染料和DNA聚合酶分開些，以便最小化光侵蝕效應。”我們已經在試驗一種新型改良的聚合酶，這個酶在構象上有一個類似盾牌的遮光保護折疊，從初期數據看還比較樂觀, 可以實現平均讀長超過9 Kb，單個SMRT Cell數據產出超過1 Gb。

Stephen Turner：

PacBio公司和美國東北大學從NHGRI獲得82.5萬美金，為期3年，用于研究如何在PacBio RS系統上減少DNA起始量并縮減測序費用。這個項目將把Wanunu于2010年發表在Nature Nanotechnology上的電場控制法應用到SMRT測序的DNA上樣過程中，形成一個納米門控系統，“當有一個DNA分子落入后，ZMW孔的門會關閉并阻止其他DNA分子進入”。“現階段我們不得不靠擴散法上樣（Magbead自動化上樣系統除外），依賴基于泊松分布的隨機落入方式，有時我們在一個ZMW孔中僅看到一個DNA分子，有時可能沒有或超過一個，很明顯這個方法的產量不高。所以如果ZMW孔有個控制的門，我們就可以做到讓每一個ZMW孔都能有效獲得一個DNA模板，這樣每個測序單元都能產出數據。”這個辦法最直接的效果是使測序通量提高至3倍。
 
靜電門控法同時還可以有效降低DNA上樣量。“電驅動可以實現遠距離DNA上樣，還可以兼容低濃度DNA，最終的DNA上樣量可以減少至幾百至1000倍。”能夠利用有限的DNA樣品將使PacBio系統的應用得到拓展。“比如它可以進行癌癥活組織樣品測序而不需要太多DNA，或者更經濟地使用儀器獲得更多的覆蓋度，還有其他諸如法醫取證和考古鑒定等應用，有了門控法的幫助這些都可以實現。”
 
對于我們來說，Wanunu發明的靜電門控法還有其他潛在用途，比如可以對單個特定的DNA模板進行分配控制。“在模板群中指定一條特定的DNA分子，讓它到達某個ZMW孔進行測序,這完全又是另外一種我們想采用的模式。”

Meni Wanunu：

門控的方法需要在ZMW孔的底部嵌入一個納米孔。“如果你把ZMW看作一個孔，需要每個ZMW孔僅容納一個單分子模板，那么我們的辦法是在里面放一個更小的孔（直徑是原先的1/50），就可以使單分子上樣率從之前的37%提高到100%。每個ZMW孔是有使用壽命的，你總是希望物盡其用，如果沒有DNA落入其中ZMW就被空耗了。所以門控法通過提高ZMW利用率能夠顯著降低測序費用。”

Stephen Turner：

美國NHGRI于2012年9月14日對外宣布已注入1900萬美金用于鼓勵發展一系列新的研發項目，希望將DNA測序費用進一步降低。其中英特爾公司（Intel）、PacBio公司、荷蘭屯特大學（University of Twente）、哥倫比亞大學組成的研究團隊因此獲得了NHGRI授予的500萬美金，為期4年，用于研發基于電化學標記DNA堿基的單分子實時測序儀。“這是我們靈光一閃想到的，可以把Intel公司和PacBio公司現有的獨門絕技結合起來發揮威力。”

“我們正研究采用4種具有區分度的電化學標簽作為追蹤手段，來記錄SMRT測序過程中對應核苷酸摻入DNA鏈的過程，即記錄電信號而非熒光信息。我們將用電化學追蹤法替代現有的光學追蹤法，這樣就不需要分光技術了。”這種技術的優勢是不再依賴復雜的光學系統，而通過氧化還原循環反應放大信號，在電路上可以采用互補型金屬氧化物半導體（CMOS），因而有望讓儀器在整體尺寸上能夠靈活控制，可以簡化系統并最終縮減測序費用。同時加入這個研發項目的還有哥倫比亞大學和荷蘭屯特大學，他們分別擅長電路設計和單分子物理混合。

“但目前我們與Intel公司等的合作還處于探索性的研究階段，現在就談換代升級還為時過早。”對于PacBio公司自身的研發傾向而言，還是會把重心放在繼續整合熒光追蹤和光學系統上。2012年夏天，我們與比利時非盈利納米電子學公司Imec開始合作開發微芯片，Imec公司的優勢是開發緊湊型單片集成設備，我們合作的目的是“將現有SMRT熒光追蹤平臺進行集成小型化，以便降低費用并進一步提升性能和速度”，目前的進展讓我們感到“非常滿意”。

Madoo Varma:

“這個項目終于開始動手了，我們很興奮，也很榮幸能與NIH和四路團隊攜手合作。”事實上，Intel公司內部很早就在為DNA測序相關的研發工作蓄勁，今年早期我們公布了一項早期成果，用改良版的場效應晶體管裝置和電化學標簽法記錄DNA聚合酶反應。“理想情況下，單分子邊合成邊測序反應完全可以做到大規模并行，DNA聚合酶的體外合成效率可以高達1毫秒/堿基。但要達到同樣目的，光學系統就需要設計得非常復雜，前提需要有效收集光子能量，從而導致高密度檢測實現起來不那么容易。要克服光學技術壁壘，最有前途的方式是把生物現象轉化為電信號來檢測。”

Edwin Hauw：

“單分子實時測序結果分析無需投入復雜又昂貴的軟硬件設施，這無疑將為客戶提供很大的靈活性，真正意識到PacBio RS系統的潛力。通過和Cycle Computing公司合作，充分利用他們在云計算方面的專長，我們將建立一個可以不斷擴展的、高性能的云端數據分析系統，我們的目標是為客戶提供性能和便捷性之間最佳的平衡。”

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• 總裁展望

Michael Hunkapiller：

在2012年第一季度，PacBio著手為早期安裝客戶逐一升級至C2試劑，其結果是“極大提高了儀器的產出性能和數據可靠性”。之前聲稱遭遇問題的客戶在升級后普遍反映這是“實質性的改善”，包括SMRT Cell的數據產出量也有提升（計劃到2014年提升至現有水平的45倍），并因此加大了儀器的使用頻度。

我們仍然會“把提升已有客戶的使用經驗放在首要位置”，之前我們也做的很到位，從不斷攀升的耗材定點就可以看出來，說明“我們的客戶已經抓住了PiaBio的價值精髓，并開始不惜投入了”。“正是這些客戶將最終成為我們最好的銷售向導，而PacBio的獨特價值將逐漸引導客戶進入下一輪訂購潮。”

接下來，我們也非常希望早期客戶能用PacBio技術獲得矚目的成就，可以通過發表或其他公布的方式分享他們的研究成果，用客戶的成功去為我們贏得更多地理性支持。同時我們還在不斷改進測序工作流程，主要體現在樣品準備和分析方法環節，“以定制的方式支持特定的應用，如微生物de novo測序、混合拼接、復雜區域的靶向重測序等”。通過這種“一應俱全的應用解決方案”模式，去贏得那些“拿來就用的的非技術熱衷者”的親睞。

PacBio并沒有把第二代高通量測序作為直接的競爭對手。“我們把它們看做同伴，可以在諸如混合拼接等應用場合相輔相成，客戶自行決定各取所需。”

（當被問及是否準備出新款儀器替換PacBio RS）“儀器換代還為時過早，有很長一段路要走。我們現在所說的‘升級’都是旨在增強現有儀器的性能，比如有些通過軟件、有些通過簡單的硬件升級、大部分是應用試劑盒和生物信息學工具的開發，然后我們把這些東西都整合進現有的儀器平臺上。我們認為現在儀器的性能已經比幾個季度前有了實質性的提升。當然我們也充分考慮到了現有儀器平臺的使用期限，但現在還遠遠沒到這個時間點。”

（針對BGI欲并購Complete Genomics一事）“我們不會走這條路的。我們目前不缺現金流，即使按照當前燒錢的速度，這些現金流完全足夠支撐到2014年年中。我們也還有其他融資渠道，如果我們認為今后需要的話。我們的基礎已經搭建好了，裝機量也在攀升，我們也擁有了一些鐵桿用戶，PacBio技術對于他們正在做的一些科研項目具有不可替代性。從長讀長角度而言，PacBio仍然是獨一無二的。我們還在不斷推進PacBio的通量，以期從這個方向累積PacBio的未來期望值，這一天一旦到來，就是我們開始全方位抗衡其他技術的時候。我們必須不斷付諸實施，但我們認為一定可以做到，對此我們非常自信。”

10-15年后，隨著技術的成熟以及市場的壯大，第三代測序將最終取代二代測序。“我相信15-20年前，很多人會認為Sanger測序法是個巨大突破，這個方法怎么也不會過時。然而隨著二代測序法的價格越來越親民，Sanger法就迅速落幕了，可能馬上就要退出歷史舞臺。三代測序法如今所處的位置就如同2000年代二代測序法所處的位置一樣。”

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• PacBio亞洲代理和測序服務公司

Ken Tominaga：

我們有幸能成為了PacBio在日本的獨家代理，如今，日本已經有7臺PacBio裝機量。“單分子測序是個非常有前景的技術，我們相信日本生物界對該技術的感興趣程度還會與日俱增。”

Cheung To：

“我們非常榮幸能成為PacBio公司在中國大陸和香港的獨家經銷商，也非常期待能把這一突破性的創新技術帶入中國。PacBio RS系統正為我們展開全新的視角，我們同時盼望SMRT 技術能為中國測序界帶來前所未有的悸動。”

Chen Shilin:

我們購買的PacBio單分子測序儀是亞洲第一臺。“我們計劃將PacBio RS系統用于揭示藥用植物及其病原體的遺傳結構，最終實現有效保護、開發、利用藥用植物資源的目的。”在未來還將對外提供商業化三代測序服務。

Jong Lee：

DNA Link已經在韓國安裝了一臺PacBio，從而成為亞洲第一家提供商業化三代測序服務的公司。“單分子測序技術即將開啟測序應用的新紀元。”

Georg Gradl：

之前我們在多個項目中“十分仔細地檢測過”PacBio的性能，這些項目包括細菌、真菌和高等植物基因組測序。“我們同時希望，結合我們多年來在de novo測序領域的知識、技能和經驗積累，能最終為三代測序技術的改善提高作出應有的貢獻。”我們公司在歐洲、美國和亞洲設有多個辦事處，并在2011年5月正式開始對外提供三代測序服務。

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生物通往期文章

1. PacBio RS第三代單分子測序系統全球訪談紀要（一）
2. PacBio RS第三代單分子測序系統全球訪談紀要（二）
3. PacBio RS第三代單分子測序系統全球訪談紀要（三）
4. PacBio RS第三代單分子測序系統全球訪談紀要（四）
5. PacBio助力100K基因組計劃 從頭解密10萬種食源性致病菌

近期相關會議推薦

為全面總結疾病遺傳學和基因組學研究進展，探討后GWAS時代疾病發病機制研究的機遇與挑戰，推動轉化醫學發展，茲定于2013年5月16-18日在上海舉行第三屆《自然遺傳》疾病基因組學國際研討會（Workshop）。

論壇由《Nature Genetics》（《自然遺傳》雜志）聯合安徽醫科大學，上海交通大學和復旦大學共同主辦，Myles Axton博士與張學軍教授共同任執行主席。論壇主題是“From GWAS to Precision Medicine”，主要圍繞復雜疾病的發病調控表達研究，復雜疾病全基因組關聯研究meta分析，復雜疾病表觀遺傳學研究，全基因組外顯子測序搜尋疾病遺傳變異及轉化基因組學研究。

論壇將邀請來自《自然遺傳》、美國哈佛大學、美國華盛頓大學、美國科羅拉多大學、英國倫敦大學、英國鄧迪大學、新加坡國立大學，中國醫學科學院、上海交通大學、復旦大學、浙江大學、同濟大學、中山大學、中南大學及第二軍醫大學等國內外相關單位權威學者參會。PacBio公司創始人兼首席科技官Stephen Turner先生受邀參會，將在會議期間分享PacBio RS系統特有的單分子實時測序（SMRT）技術在后GWAS時代的創新應用。

報告題目：Extremely Real Long Reads Using SMRT Sequencing as a Follow Up to Post-GWAS Candidate Regions

報告人：Stephen Turner, Founder & CTO at Pacific Biosciences

報告時間：12:50-13:50, 2013/05/17

報告地點：上海浦西洲際酒店（恒豐路500號）3樓豪華宴會廳 （即第三屆《自然遺傳》疾病基因組學國際研討會會場）

Abstract:
Pacific Biosciences Single-Molecule Real Time DNA sequencing technology provides the longest readlength of any sequencing technology, with consensus accuracy equal to or higher than any other technology and at a per-run price lower than any second-generation system.  These qualities, coupled with our DNA barcoding/multiplexing methods make it ideal for following up on leads generated by GWAS or second-generation sequencing.  I’ll survey a selection of projects that highlight these benefits including applications in cancer biology, HLA typing, repeat expansion analysis, and haplotype phasing.  With the recent release of the RS II (and its associated upgrade for existing instruments), throughput with targeted amplicons can be as high as half a gigabasepair per 2-hour run, leading to a powerful and economical tool that permits examination of the full range of heritable features found in DNA from accurate SNP calls to haplotypes to repeat expansions and structural variants.  I’ll finish with a perspective on the future of amplification-free targeting of genomic loci so that epigenetic marks can be examined at the same time.

會議網址：http://www.natureasia.com/en/events/gwas-2013/