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        生物通首頁 > 今日動態(tài) > 專題總匯 > 全球訪談紀要:PacBio RS第三代單分子測序系統(tǒng)
        引言
                第三代單分子測序概念一經(jīng)提出,就在全球范圍內(nèi)引起了巨大反響,被譽為“未來測序應(yīng)用的基準(zhǔn)線”。
                作為第三代測序技術(shù)的代表,也是目前唯一面市的PacBio RS系統(tǒng),自發(fā)售至今走過了最不平凡的25個月。
                期間,幾經(jīng)褒獎,幾經(jīng)質(zhì)疑。
                有人說,它是“革命性的儀器”,讓人類首次領(lǐng)略了單分子合成觀測的魅力。
                也有人說,它“門檻太高、應(yīng)用太窄”,是個奢侈品,無法在常規(guī)場合進行推廣。
                有人說,它“粗曠而不失細膩”,既能長讀長覆蓋,又能實時動態(tài)記錄單堿基信息。
                也有人說,它“眼高手低”,高錯誤率似乎是個硬傷。
                期間,昔日的同門逐漸淡出江湖。
                Helicos已申請破產(chǎn)保護,Complete Genomics難逃被收購的命運,Oxford Nanopore雖然呼聲很高,但宛若空中樓閣遲遲不見現(xiàn)身。唯有PacBio還在奮力前行。
                業(yè)界騷動!!不是為了二代測序保住了市場而歡呼,而是為了三代測序的命運坎坷而憂愁,更是為了PacBio的碩果僅存而思考。
                “它到底還能走多遠,它到底能走得多好?!”
                問這個問題的人很多,有專家,有媒體,有在用用戶,有觀望用戶,還有大批熱衷于新技術(shù)的科研粉絲。
                特此收集了PacBio問世以來的一些媒體采訪、專家點評、用戶心得、官方發(fā)言,以主題形式匯編梳理,期望用“原汁原味”的方式,為您呈上2013年的一道“訪談燴菜”。作為談資也罷,作為解惑也罷,只要您曾經(jīng)關(guān)注過第三代測序,或者正在關(guān)注第三代測序。

        PacBio公司創(chuàng)始人
        Stephen Turner


        PacBio公司創(chuàng)始人
        Jonas Korlach



              主題一:PacBio單分子實時測序技術(shù)存在的價值


        Broad研究院把PacBio RS系統(tǒng)作為基因分型驗證的首選工具
                我們分別利用PacBio平臺和Illumina MiSeq平臺進行對比驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PacBio數(shù)據(jù)有著更好的準(zhǔn)確性和假陽性檢出率,相對而言是一種更為有效的驗證工具。
        ——Mauricio Carneiro(美國Broad研究院醫(yī)療和人口遺傳學(xué)項目組計算生物學(xué)家)
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        如何正確看待錯誤率和測序數(shù)據(jù)質(zhì)量
                隨機錯誤是相對比較容易用概率算法進行修正的,但修復(fù)系統(tǒng)性誤差就不是統(tǒng)計學(xué)能夠解決的范疇了!覀冮_發(fā)的算法將PacBio錯誤率從15%減少為不到千分之一。
        ——Michael Schatz(美國冷泉港實驗室沃森生物科學(xué)學(xué)院定量生物學(xué)助理教授)
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        擁有高質(zhì)量參考基因組和缺口修復(fù)工作的重要性
                大量的基因組空白區(qū)域中可能存在重要的生物學(xué)信息,如果無法補齊Gap,不僅不能獲得完整的基因圖譜,還會給后續(xù)的關(guān)鍵信息解讀造成很大的困難。
        ——Richard Gibbs(美國Baylor醫(yī)學(xué)院人類基因組測序中心總監(jiān))
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        PacBio在揭示德國大腸桿菌疫情爆發(fā)菌株中的突出作用
                在此項目證實了PacBio在復(fù)雜微生物病原體的de novo測序的能力,以及在多個基因組快速測序上的威力,這些有助于闡明病原體微生物的進化史。
        ——Eric Schadt(美國西奈山醫(yī)院基因組學(xué)和多尺度生物學(xué)研究所總監(jiān))
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        PacBio RS系統(tǒng)全球用戶總評
                為了維持基因組學(xué)的前沿地位,我們探索基因組測序中的新機會。我們計劃使用PacBio來改善病原體的de novo拼接,并提高一些物種的序列信息覆蓋度,在未來,我們將通過甲基化位點的直接檢測來探索表觀遺傳學(xué)。
        ——Harold Swerdlow(英國Sanger研究院研發(fā)部總監(jiān))
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              主題二: PacBio RS系統(tǒng)在de novo測序中的優(yōu)勢


        利用PacBio RS系統(tǒng)獨立完成微生物de novo完整測序
                在羊病微生物基因組de novo測序項目中,我們利用PacBio大于6 Kb的讀長數(shù)據(jù),只用了20X覆蓋度就拼出了1個Contig,而且這一個Contig即是一條染色體。

        ——Timothy Smith(美國農(nóng)業(yè)部肉類動物研究中心分子遺傳學(xué)專家)
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        PacBio系統(tǒng)結(jié)合二代測序技術(shù)進行高等基因組的混合拼接
                我們研究組先用Illumina數(shù)據(jù)拼出了Rhodobacter細菌的Scaffold,然后用PacBio的長讀長數(shù)據(jù)去填補Gap。在加入PacBio數(shù)據(jù)之前,一個Scaffold包含22個Contig,加入PacBio數(shù)據(jù)后,結(jié)果立即改觀,拼成了一個巨大的Contig。

        ——David Jaffe(美國Broad研究院計算研發(fā)部總監(jiān))
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        PacBio系統(tǒng)適用的混合拼接和獨立組裝軟件介紹
                我們專門開發(fā)了高度自動化的工具PBJelly,能夠?qū)acBio長片段與基因組草圖進行比對,填補或減少草圖中的缺口,從而完善基因組草圖。

        ——Adam English(美國Baylor醫(yī)學(xué)院人類基因組測序中心生物信息學(xué)家)
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              主題三: PacBio RS系統(tǒng)首次實現(xiàn)對堿基修飾進行直接測序


        堿基修飾直接測序法的經(jīng)典案例
                你可以通過監(jiān)測DNA合成得到堿基序列信息,同時,你還額外得到了每個堿基如何摻入的動力學(xué)信息。我們用PacBio對E.coli O104:H4菌株進行了“前所未有的全基因組甲基化譜分析”,共發(fā)現(xiàn)了50,000多個甲基化位點。

        ——Matthew Waldor(美國霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所研究員)
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        堿基修飾直接測序法的原理
                這就好比是開車經(jīng)過減速帶,一個凸起的路障會干擾車速。每種堿基修飾事件都會使聚合酶的“停頓模式”產(chǎn)生微小差異,最終反映到熒光脈沖信號的間隔上。

        ——Stephen Turner(美國PacBio公司創(chuàng)始人兼CTO)
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        直接測序法分析甲基化組學(xué)(Methylome)的先行者
                通過與PacBio合作完成的全基因組甲基化譜分析,我們可以找到甲基化酶的識別序列,無論是什么甲基化酶,只要它在那。這真是我們首次有能力對細菌基因組進行全方位的甲基化組學(xué)分析。

        ——Richard Roberts(1993年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎得主,現(xiàn)為美國NEB公司CSO)
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        化學(xué)標(biāo)記富集法推動堿基修飾直接測序
                我們就是想把5-hmC的檢測變得敏感些,最容易想到的是,加個標(biāo)簽以便富集信號。通過這個試劑盒,不光可以檢測出羥甲基化修飾,還可以顯著降低檢測覆蓋度。

        ——Chuan He(美國芝加哥大學(xué)生物物理動力學(xué)研究院總監(jiān))
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        堿基修飾直接測序法適用軟件和其他應(yīng)用案例
                目前軟件可以自動識別5-mC、4-mC、6-mA等堿基修飾,其它堿基修飾可參照相關(guān)文獻通過設(shè)立對照進行檢測。我們還將對軟件不斷進行升級,2013年陸續(xù)推出其他各種堿基修飾類型。

        ——Edwin Hauw(美國PacBio公司產(chǎn)品管理高級總監(jiān))
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              主題四: PacBio RS系統(tǒng)在靶向測序和臨床診斷中的獨到應(yīng)用


        SNP和Indel變異驗證、廣義單倍體型分析
                PacBio單分子測序技術(shù)能對基因組中的低頻變異進行高效解讀,且能夠有效彌補Sequenom和Sanger方法的缺陷,可以尋找除已知位點以外的其他漏檢稀有突變。

        ——Matthew Meyerson(美國Broad研究院高級成員)
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        串聯(lián)重復(fù)突變和低頻突變檢測
                我們一開始也不敢確定PacBio是否能應(yīng)付,但實際使用下來,我們低估了PacBio,在單分子檢測條件下,我們竟然能檢測到最低至2.7%的突變。

        ——Neil Shah(美國加州大學(xué)舊金山分校醫(yī)學(xué)院血液科副教授)
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        三聯(lián)核苷酸異常擴增分析
                我們證實了PacBio可以測超過750個CGG重復(fù)片段,并能夠精確定位AGG突變。這種方法保障了單堿基分辨率,今后也能完整鑒定所有與疾病相關(guān)的等位基因,從而有利于準(zhǔn)確及時的臨床診斷。

        ——Paul Hagerman(美國加州大學(xué)戴維斯分校醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)和分子醫(yī)學(xué)教授)
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        mRNA可變剪切和病毒變異分型
                而單分子測序則不同,其生成的長片段能一次性完成通讀,有助于在大范圍內(nèi)對可變剪切位點進行直接分析。此外PacBio的CCS測序模式能夠提供準(zhǔn)確度非常高的序列數(shù)據(jù),使得轉(zhuǎn)錄組可變剪切位點分析更加準(zhǔn)確。

        ——Frederic Bushman(美國賓夕法尼亞大學(xué)微生物系教授)
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        臨床快速診斷實施和無需建庫方案
                由于周轉(zhuǎn)時間的限制,PacBio RS系統(tǒng)快速測序能力也是我們選擇它的一個主要原因。我們擁有PacBio快一年了,它確實用起來又快又方便。同時,PacBio的序列無偏好性測序的特點也是一個重要考慮因素。

        ——John McPherson(加拿大安大略癌癥研究所基因組技術(shù)總監(jiān))
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              主題五:PacBio的未來方向以及為測序帶來的變化?


        PacBio系統(tǒng)的已有升級和表現(xiàn)效果
                通過最近的軟件更新,PacBio RS系統(tǒng)可以產(chǎn)出超長讀長并實現(xiàn)超高精度的從頭組裝,這極大地改善了我們的發(fā)現(xiàn)能力,以便更經(jīng)濟高效地獲得新型基因組信息。

        ——J. Craig Venter(全球知名生物學(xué)家及企業(yè)家,時代雜志2007/2008年將他選進世界上最有影響力的人之一)
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        PacBio系統(tǒng)的未來升級方向
                理想情況下,單分子邊合成邊測序反應(yīng)完全可以做到大規(guī)模并行,DNA聚合酶的體外合成效率可以高達1毫秒/堿基。要克服光學(xué)技術(shù)壁壘,最有前途的方式是把生物現(xiàn)象轉(zhuǎn)化為電信號來檢測。

        ——Madoo Varma(美國Intel公司整合生物系統(tǒng)實驗室負責(zé)人)
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        總裁展望
                我們的客戶已經(jīng)抓住了PiaBio的價值精髓,并開始不惜投入了。正是這些客戶將最終成為我們最好的銷售向?qū),而PacBio的獨特價值將逐漸引導(dǎo)客戶進入下一輪訂購潮。

        ——Michael Hunkapiller(美國PacBio公司主席兼CEO)
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        PacBio亞洲代理和測序服務(wù)公司
                我們非常榮幸能成為PacBio公司在中國大陸和香港的獨家經(jīng)銷商,也非常期待能把這一突破性的創(chuàng)新技術(shù)帶入中國。PacBio RS系統(tǒng)正為我們展開全新的視角,我們同時盼望SMRT 技術(shù)能為中國測序界帶來前所未有的悸動。

        ——Cheung To(中國香港Gene Company Limited創(chuàng)始人兼主席)
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        近期相關(guān)會議推薦
                為全面總結(jié)疾病遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究進展,探討后GWAS時代疾病發(fā)病機制研究的機遇與挑戰(zhàn),推動轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)發(fā)展,茲定于2013年5月16-18日在上海舉行第三屆《自然遺傳》疾病基因組學(xué)國際研討會(Workshop)。論壇由《Nature Genetics》(《自然遺傳》雜志)聯(lián)合安徽醫(yī)科大學(xué),上海交通大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)共同主辦,Myles Axton博士與張學(xué)軍教授共同任執(zhí)行主席。論壇主題是“From GWAS to Precision Medicine”,主要圍繞復(fù)雜疾病的發(fā)病調(diào)控表達研究,復(fù)雜疾病全基因組關(guān)聯(lián)研究meta分析,復(fù)雜疾病表觀遺傳學(xué)研究,全基因組外顯子測序搜尋疾病遺傳變異及轉(zhuǎn)化基因組學(xué)研究。
                論壇將邀請來自《自然遺傳》、美國哈佛大學(xué)、美國華盛頓大學(xué)、美國科羅拉多大學(xué)、英國倫敦大學(xué)、英國鄧迪大學(xué)、新加坡國立大學(xué),中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、上海交通大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)、浙江大學(xué)、同濟大學(xué)、中山大學(xué)、中南大學(xué)及第二軍醫(yī)大學(xué)等國內(nèi)外相關(guān)單位權(quán)威學(xué)者參會。PacBio公司創(chuàng)始人兼首席科技官Stephen Turner先生受邀參會,將在會議期間分享PacBio RS系統(tǒng)特有的單分子實時測序(SMRT)技術(shù)在后GWAS時代的創(chuàng)新應(yīng)用。
                報告題目:Extremely Real Long Reads Using SMRT Sequencing as a Follow Up to Post-GWAS Candidate Regions
                報告人:Stephen Turner, Founder & CTO at Pacific Biosciences
                會議網(wǎng)址:http://www.natureasia.com/en/events/gwas-2013/


        1380 Willow Road, Menlo Park, CA 94025
        650.521.8000
        www.pacificbiosciences.com



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