來自冷泉港實驗室（CSHL）的一位定量生物學(xué)家及其同事開發(fā)出了一種混合錯誤校正新方法，攻克了PacBio單分子測序的重大問題，可將長讀序的準(zhǔn)確度提高到99.9%。這一研究成果發(fā)布在7月1日的《自然生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）雜志上。

領(lǐng)導(dǎo)這一研究的是冷泉港實驗室助理教授Michael Schatz以及馬里蘭大學(xué)和國家生物防衛(wèi)分析和對策中心的Adam Phillippy 和 Sergey Koren。

在這篇文章中，研究小組開發(fā)了一個軟件包可校正PacBio單分子測序中的一個嚴(yán)重問題：單分子測序中的堿基錯讀。但PacBio單分子測序的主要優(yōu)點是測定的讀序片段比當(dāng)前其他二代測序技術(shù)長100倍，由此獲得的基因組結(jié)構(gòu)信息比目前第二代測序技術(shù)更完整。

Schatz及研究團隊通過一種數(shù)學(xué)算法保留了PacBio測序技術(shù)的巨大優(yōu)勢，消除了它的主要缺陷。他們將測序讀序錯誤率從15%減少為不到千分之一。這一數(shù)學(xué)算法以開放源代碼的形式發(fā)布到萬維網(wǎng)上，大大提高了第三代測序在整個生物醫(yī)學(xué)研究界的實用性。

研究人員將這種算法應(yīng)用于多種生物測序中，小到噬菌體病毒，大到復(fù)雜的鸚鵡基因組，都得到了良好的結(jié)果，展示了PacBio單分子測序技術(shù)廣泛的應(yīng)用范圍。

“一條染色體，一個重疊群”

使用這種方法使PacBio單分子測序技術(shù)的長讀長優(yōu)勢得到了良好的展現(xiàn)，其存在的高錯誤率也得到了糾正，能夠高效并精確的組裝基因組，使得“一條染色體，一個重疊群”的目標(biāo)的實現(xiàn)變的可能。

鸚鵡基因組大小超過人類基因組的三分之一，而發(fā)現(xiàn)鸚鵡基因組的優(yōu)越性就要歸功于第三代PacBio測序的長片段讀序優(yōu)勢。當(dāng)前使用的第二代測序技術(shù)生成大量的短的重疊群，而每個片段的一致版本是許多讀序疊加的結(jié)果，雖然非常精確，但這些拼圖小塊太短，難以用來精確裝配特定基因組區(qū)域，如包含長重復(fù)序列的區(qū)域。

而PacBio單分子測序技術(shù)生成的重疊群更長，能更好組裝較大的基因組片段，包括那些長重復(fù)片段。Schatz和研究團隊希望在提高測序準(zhǔn)確率的同時保留單分子測序的這一優(yōu)勢,他們通過有效結(jié)合第二代和第三代測序技術(shù)的優(yōu)勢做到了這一點。

這種方法被稱為‘混合錯誤校正（hybrid error correction），研究人員充分利用了第三代測序儀Pacific Biosciences RS的讀長優(yōu)勢，并在其中混入第二代測序儀生成的精確短讀序數(shù)據(jù)。用公共基因組裝配程序Celera Assembler處理這兩種數(shù)據(jù)，生成的裝配結(jié)果準(zhǔn)確性達(dá)到99.9%，拼接的重疊群平均長度是第二代測序儀所能得到的兩倍以上。隨著單分子測序技術(shù)的發(fā)展，預(yù)計這一混合方法得到的重疊群還會增長。

高效快速的de novo拼接有助于發(fā)現(xiàn)大片段的結(jié)構(gòu)變異，對理解癌癥基因組和存在融合基因、拷貝數(shù)變異和大范圍結(jié)構(gòu)變異的疾病遺傳變化具有重要意義。

高質(zhì)量的基因組裝配對于基因組注釋和比較基因組分析尤為重要。許多微生物基因組分析取決于基因組測序的完成，但舊測序技術(shù)成本高昂。對高等生物進行高質(zhì)量的基因組分析則依賴于測序捕捉到詮釋基因的DNA片段。近年來研究發(fā)現(xiàn)基因組中存在自發(fā)性的結(jié)構(gòu)改變，即拷貝數(shù)變異，這使得通過長片段DNA讀序和組裝獲得病患個體清晰準(zhǔn)確的全基因組信息非常重要。

Schatz和他的同事們通過混合第二代測序技術(shù)進行錯誤校正的方法，使PacBio測序讀序相關(guān)的錯誤率不再是基因組裝配的障礙。利用PacBio測序技術(shù)的長讀序結(jié)合與之互補的短讀序可以有效進行基因組裝配，完成此前不可能實現(xiàn)的測序任務(wù)。

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