PacBio®長讀序為基因組完成帶來了新變革。資深基因組裝配專家開發(fā)的錯誤校正軟件使科學(xué)家能在其短讀取數(shù)據(jù)中添加長讀序數(shù)據(jù)，最終將那些未完成的基因組補(bǔ)全。

        在過去的十年，基因組裝配讓一些科學(xué)家渴望轉(zhuǎn)向新的挑戰(zhàn)，但Michael Schatz卻不同，他認(rèn)為近來創(chuàng)新測序技術(shù)的長讀序為這一領(lǐng)域帶來了新的生命力。“基因組裝配的前沿發(fā)展迅速，”他說。“這正是基因組測序激動人心的時刻�！�

        Schatz是冷泉港實驗室的助理教授，在國家生物防衛(wèi)分析和對策中心的Adam Phillippy 和 Sergey Koren領(lǐng)導(dǎo)的基因組裝配項目中做出了卓越貢獻(xiàn)。他們的目標(biāo)是應(yīng)用PacBio®RS測序儀生成的長讀序顯著提高基因組裝配的質(zhì)量，甚至直接將讀序裝配成高質(zhì)量的完成基因組。他們的研究成果發(fā)表在2012年7月1日的Nature Biotechnology雜志上。

        Phillippy和Schatz從事了十余年基因組裝配，Schatz回憶起他們在基因組研究所進(jìn)行細(xì)菌基因組裝配項目時的情形，“那時要完成基因組裝配的最后一步，補(bǔ)全每一個缺口，極其昂貴�！�

        那還是Sanger測序的時代，Sanger測序被認(rèn)為是高質(zhì)量基因組裝配的基礎(chǔ)金標(biāo)方法。幾年后短讀序測序技術(shù)開始流行，Schatz及其同事發(fā)現(xiàn)隨著contigs重疊群數(shù)量、重復(fù)、片段倍增的顯著增加，要準(zhǔn)確裝配基因組反而變得更加困難。從那時起，Phillippy、Koren and Schatz就開始致力于需求昂貴的Sanger測序以外的方法，來獲得高質(zhì)量的基因組裝配。

    “我們非常興奮，這一技術(shù)能解決我們數(shù)年來面臨的許多困難”

        當(dāng)他們聽說Pacific Biosciences公司將推出長讀序的測序平臺，“我們非常興奮，這一技術(shù)能解決我們數(shù)年來面臨的許多困難，”Schatz說。

        和其他新測序技術(shù)一樣，PacBio SMRT^®測序方法意味著科學(xué)家們需要學(xué)習(xí)如何對數(shù)據(jù)進(jìn)行評估和應(yīng)用。該測序技術(shù)的單分子特性所得初始讀取的錯誤率較高。

        短讀序測序儀將許多序列重合在一起只報告檢出一致的堿基，從而提高單次讀序的準(zhǔn)確性，Phillippy、Koren和Schatz相信也能以同樣的方式優(yōu)化PacBio的讀取。他們決定對Celera^®裝配程序進(jìn)行升級來適應(yīng)新型數(shù)據(jù)，并在這一過程中意識到長讀序數(shù)據(jù)的確是獲得更清晰的高質(zhì)量基因組裝配的良機(jī)。

研究團(tuán)隊的主要突破是開發(fā)出了一種錯誤校正方法，該方法利用PacBio RS測序儀的長讀序優(yōu)勢，混入精確度高的短讀取數(shù)據(jù)，然后通過Celera Assembler軟件進(jìn)行處理，生成高質(zhì)量的基因組裝配。“我們開發(fā)的軟件結(jié)合了多方優(yōu)勢，處理數(shù)據(jù)非常完美。”Schatz說�！皫缀跬耆�補(bǔ)償了明顯較高的初始錯誤率�！边@篇發(fā)表在Nature Biotech雜志的文章顯示，通過這一方法，讀取精確性達(dá)到了99.9%以上，并且contig的平均長度是短讀序技術(shù)的兩倍。

 “研究團(tuán)隊在多種生物的基因組測序中證明了該方法的有效性，從簡單的微生物到高等真核生物，‘這一方法十分有效’”

長讀序的優(yōu)勢

       Phillippy、Koren和Schatz堅信長讀序技術(shù)是高質(zhì)量基因組裝配的關(guān)鍵，這在某種程度上與科學(xué)界的趨勢背道而馳。使用短讀序測序儀的大多數(shù)科學(xué)家只是簡單的通過他們的平臺獲取更高的覆蓋度，以期改善其感興趣的生物基因組的裝配。

        那為何Phillippy、Koren和Schatz不采取同樣的措施呢？他們深厚的基因組裝配背景告訴大家，這樣不可行�！拔覀冎�道短讀取的信息不夠，”Schatz說。“如果我們能從長讀序中提取信息，我們就能確定能夠做出好的裝配�！�

        這些科學(xué)家知道長讀序?qū)τ诨�因組裝配是關(guān)鍵的，而短讀序測序儀永遠(yuǎn)無法將讀長提高到數(shù)千堿基�！拔覍�合成測序技術(shù)感興趣的原因就在于它的反應(yīng)能達(dá)到10,000個堿基長，而化學(xué)過程是無法維持這么多循環(huán)的，”Schatz說。“要得到長讀序，就只能使用單分子測序。”

        而單分子測序存在的問題就是該技術(shù)固有特性會使初始數(shù)據(jù)錯誤率高，Schatz補(bǔ)充道。“由于我們一次檢測一個單分子，這一過程中就會遇到各種各樣的錯誤，”相比之下，短讀序測序系統(tǒng)采用多個序列的一致序列，掩蓋了單個錯誤，這些系統(tǒng)不會報告單分子錯誤率。

        單分子測序技術(shù)特別有利的一點在于，一些短讀序測序平臺生成的數(shù)據(jù)帶有系統(tǒng)誤差，而PacBio數(shù)據(jù)的誤差是隨機(jī)性的。而對于信息學(xué)專家來說，隨機(jī)誤差可以通過算法來識別并校正，而系統(tǒng)誤差則不能。

        Schatz還強(qiáng)調(diào)，單分子測序還具有基因組裝配以外的優(yōu)勢。在他們的文章中，Phillippy和Koren對其合作者聯(lián)合基因組研究所的Zhong Wang生成的玉米轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了初步分析。Schatz說，“在這項工作中，我們并不是嘗試推斷選擇性剪切，而是直接讀取了選擇性剪切的位點。而沒有單分子測序技術(shù)這就無法實現(xiàn)。”錯誤修正軟件，使此前無法實現(xiàn)的應(yīng)用成為可能。

軟件的開發(fā)

       這一項目的研究團(tuán)隊成立于多年以前：Phillippy、Koren和Schatz都是馬里蘭大學(xué)Steven Salzberg和Mihai Pop的學(xué)生，同時也是TIGR和JCVI研究所的同事。研究團(tuán)隊還包括，以鸚鵡作為語言發(fā)育研究模型的共同作者Erich Jarvis，以及JCVI的Brian Walenz。

        在為PacBio數(shù)據(jù)開發(fā)糾錯工具的過程中，科學(xué)家對幾種長讀序校正方法進(jìn)行了評估。研究人員評估其中的一個變量是時間點，即何時進(jìn)行錯誤校正�！耙粋�常用策略是先只對Illumina只是短片段的數(shù)據(jù)進(jìn)行裝配，然后比對PacBio讀序，我們稱之為混合搭建技術(shù)，”Schatz說。“將PacBio長讀序與Illumina的重疊群進(jìn)行比對能有效對長讀序的錯誤進(jìn)行校正�！�

        但這種方法并沒有達(dá)到Phillippy和Schatz的預(yù)期效果�！拔覀儼l(fā)現(xiàn)如果在短讀序 裝配中存在任何問題——例如重復(fù)序列重疊collapsed、存在嵌合contigs或者裝配出許多分散的片段——就很難有效應(yīng)用那些長讀序，”Schatz說�！斑@使我們轉(zhuǎn)而致力于提前進(jìn)行錯誤校正�！�

        的確，最終的方法需要先將短讀序定位到PacBio長讀序上，然后用校正過的讀序進(jìn)行裝配。事實證明要有效將短讀序定位到長讀序上也是一個挑戰(zhàn)，“我們最終使用了一種較為強(qiáng)力的方法，采用非常短而精確的配對，”Schatz說�！拔覀兺ㄟ^改進(jìn)Celera Assembler做到了這一點。”

     另一個復(fù)雜的問題是，當(dāng)長讀序主要由重復(fù)序列構(gòu)成時，如何精確比對短讀序�！坝绕涫钱�(dāng)這一重復(fù)具有高于99%的一致性時，要正確識別相應(yīng)短讀序并將其定位到長讀序上，就相當(dāng)麻煩�！睘榱私鉀Q這一難題，研究人員對每條短讀序最可能的比對序列進(jìn)行了評估，然后仔細(xì)評價比對覆蓋度，最終確定最佳配對。 “我們花了很多時間來優(yōu)化能區(qū)分這些重復(fù)的最佳算法，”Schatz說。

        這一項目的所有代碼都是公共資源，能通過SourceForge網(wǎng)站上的Celera Assembler軟件取得相關(guān)文檔。http://wgs-assembler.sourceforge.net.

短讀序數(shù)據(jù)集結(jié)號

“這一領(lǐng)域潛伏著PacBio應(yīng)用的巨大需求”

研究團(tuán)隊評估的另一個變量是哪種短讀序用來校正PacBio數(shù)據(jù)最好，但他們并沒有發(fā)現(xiàn)強(qiáng)偏向性，Schatz說。“PacBio CCS、Illumina 或者454 生成的讀序都能適用�！比魏螠y序平臺都適用，不過他推薦用戶采用25x到50x的短讀序覆蓋度，然后加入PacBio長讀序的“even moderate 覆蓋度”。

        這種錯誤校正方法不僅能為準(zhǔn)備進(jìn)行基因組測序的研究者帶來幫助，同樣也為長期使用Illumina® 或454®系統(tǒng)進(jìn)行測序但還未得到高質(zhì)量基因組裝配的研究者帶來了福音。結(jié)合PacBio長讀序數(shù)據(jù)，能使舊日蒙塵的測序數(shù)據(jù)產(chǎn)生新的價值�！斑@一領(lǐng)域潛伏著PacBio應(yīng)用的巨大需求，” Schatz說。

        對于那些有短讀序數(shù)據(jù)并且在對同一生物進(jìn)行測序的科學(xué)家來說，“錯誤校正方法是一個即用型實用工具，”Schatz說。研究團(tuán)隊在多種生物的基因組測序中證明了該方法的有效性，從簡單的細(xì)菌到高等真核生物，“都相當(dāng)有效” Schatz補(bǔ)充道。

“就是這么簡單，運(yùn)行一個命令，軟件就能將15%錯誤率的讀取變成完美的數(shù)據(jù)，”他說。“看到運(yùn)行前后的差別，效果相當(dāng)驚人�！�

 “將細(xì)菌染色體組裝為單個重疊群，這絕對是你能期望得到的最好結(jié)果�！�

       對于選擇性剪切或者宏基因組學(xué)研究等更復(fù)雜的項目，Schatz建議研究人員與文章作者直接聯(lián)系，聽取能有效調(diào)試這一程序的建議。該軟件也能用于轉(zhuǎn)錄組或宏基因組研究，他說，但SourceForge網(wǎng)站上的這個軟件 “實際上是設(shè)計并調(diào)試用于單個基因組的�！备�多信息參見研究團(tuán)隊發(fā)表在Nature Biotechnology雜志上的文章，文中包括1.2Gb鸚鵡基因組的de novo重頭組裝。Schatz強(qiáng)調(diào)說，文章中分析的數(shù)據(jù)是約一年前的，此后PacBio技術(shù)的新進(jìn)展已經(jīng)改善了基因組的裝配�！艾F(xiàn)在又有了激動人心的新進(jìn)展，”他說，尤其是Sergey Koren“將細(xì)菌染色體組裝為單個重疊群，這絕對是你能期望得到的最好結(jié)果�！�

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