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生物通首頁 > 今日動態 > 專題總匯 > 第三代測序系統PacBio RS

今年4月，美國Pacific Biosciences 公司正式發售第三代測序系統—PacBio RS。這是一臺革命性的DNA測序系統，它融合了新穎的單分子測序技術和高級的分析技術，在測序歷史上首次實現了人類觀測單個DNA聚合酶合成過程的夢想。它有著其他系統無法比擬的序列讀長，高達3000 bp！

Pacific將會在明年初正式發布新版本C2試劑。我想，大家除了被其長讀長所吸引之外，也肯定很關心PacBio RS的準確性、速度、可擴展性和費用，以及它會在目前呈三國鼎立之勢的測序市場中扮演什么樣的角色。為此，生物通特邀了PacBio RS中國代理——基因有限公司專門負責PacBio的技術專家，就大家普遍關心的這些問題進行了比較深入的探討。

生物通對話基因有限公司專門負責PacBio的技術專家：

關于讀長

“如果把拼接工作看作是在做拼圖游戲。NGS獲得的讀長都很短，就好象把一幅圖打成非常小的碎片，然后做拼圖。由于碎片太小，因此許多碎片看起來都差不多，這樣要拼出一副完整的圖難度很大。PacBio RS

關于準確性

“PacBio平臺上目前的錯誤主要是插入和缺失，只有大概1%是substitution。缺失錯誤源自于有時候堿基摻入速度過快，超過了PacBio相機的拍攝幀數。插入錯誤源自于有的時候酶隨機的選擇一些堿基，但并未將這些堿基真的摻入

目前可以獲得1300bp的平均讀長，明年初隨著試劑升級，平均讀長可提升至2500-3000bp，這就相當于同樣的一幅圖，用大的碎片來做拼圖，由于大碎片比小碎片的識別度要高，因此完成拼圖的難度就可以大幅降低。”詳情

關于速度和運行通量

“目前PacBio上所使用的DNA聚合酶的合成速度大概是1-3個堿基/秒，由于在該平臺上，聚合酶合成的過程就是序列解讀的過程，這意味著測序速度每分鐘可超過100個堿基。從樣品制備到獲得堿基序列的全部流程可在1天內完成。”

“如果使用C2試劑，每個SMRT cell可以獲得90M 的可定位數據。現階段每天最多可運行12個SMRT cell，因此每天可獲得的數據是12×90=1080Mb”詳情

“我們的重點之一是de novo測序。對于de novo測序，我們之前不了解其基因組——如宏基因組環境、真菌、植物等——長讀取確實是一個優勢，因此PacBio的確有幫助。”

Eddy Rubin
美國能源部聯合基因組研究所主管

合成鏈中。由于這些錯誤是隨機的，因而可以隨著測序覆蓋深度的增加而消除。因此，盡管PacBio的單分子單次讀取的原始準確度并不非常高，但隨著測序覆蓋深度的增加，它可以獲得比NGS平臺更高的一致性準確度。”詳情

關于價格和市場

“你不能只看單價，或者單次運行的成本，因為不是運行結束，軟件自動出來的結果就可以打印發表。如果考慮到長讀取的優勢和在數據拼接上能節省的時間和費用，PacBio RS有其他方法不可比擬的優勢。關鍵是它是否能滿足你的需要，幫助你快人一步達到目標。”

“現階段PacBio平臺和NGS平臺更多的是一種互為補充的關系，NGS可以獲得更多的數據量，而PacBio可以獲得更多的信息量。”詳情

■ 單分子實時（SMRT）測序技術

原理

眾所周知，天然的DNA復制本身就是一個非常高效且準確的過程。真核生物DNA復制的速度達幾十個核苷酸/秒。若能以這樣的神速測序，那可比Sanger測序快了幾萬倍。然而，知易行難。如何在不影響聚合酶活性的前提下實時觀察DNA合成，這可是個棘手的問題。要知道，DNA聚合酶的直徑只有15 nm。而且，這是一個涉及酶學、表面化學和檢測光學的多學科難題。讓我們來看看Pacific Biosciences的創始人如何克服三大挑戰，開發出PacBio RS。詳情

重大升級

PacBioRS新版本的C2試劑將在今年年底或明年年初正式發布，C2試劑可使該系統的平均讀長從現在的1300bp提升至2700bp！這是單分子實時測序技術的重大飛躍，有望一掃新一代測序之讀長太短數據處理量太大的弊病。一天內可以完成從樣品制備到完成測序并獲得序列信息的全過程，很有希望實現便宜的個人基因組測序。詳情

■ PacBio RS的應用

甲基化分析

甲基化研究如今開展得如火如荼。除了人們熟知的5-mC，另一種修飾方式——5-mC的羥基化形式5-hmC也引起人們注意。但現有的測序方法如

高GC含量區域測序

美國加州大學戴維斯分校醫學院利用單分子實時測序技術，對脆性X染色體綜合征的關鍵基因FMR1中的CGG三核苷酸重復區域進行了測序。

亞硫酸氫鹽測序，無法區分5-mC和5-hmC。美國芝加哥大學利用第三代單分子SMRT測序技術和5-hmC的選擇性化學標記方法來高通量檢測5-hmC。通過聚合酶動力學帶來的寶貴信息，研究人員可直接檢測DNA甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。詳情

病原微生物鑒定

由于PacBio從樣本制備到獲得序列信息所需時間非常短（<1天），在具有時效性的病原微生物鑒定中（例如生物反恐、流行病爆發監控等）也非常有優勢。一個國際小組利用Pacific Biosciences的單分子測序技術，深入研究了歐洲大腸桿菌菌株的致病性和進化起源，該研究成果發表在《新英格蘭醫學雜志》上。詳情

“SMRT技術的突出特點是我們不僅能夠了解DNA如何合成，還能通過它產生的數據定量分析基因調控、RNA功能、表觀遺傳調控、DNA修飾和基因組結構。”

Nikolaus Rajewsky教授
柏林Max Delbruck分子醫學中心

一般CGG重復在200次以上，被認為是具有臨床意義的，但這個長度不管對于Sanger法測序或者新一代測序來說，都是很困難的，而PacBio則很好的解決了這個問題。詳情

稀有突變檢測

二代測序檢測的是經過 PCR 擴增后的大量分子的總信號，一方面 PCR 擴增過程中的錯配等，會變成系統誤差影響最終的測序結果。另一方面，稀有變異在擴增過程中，很容易被淹沒在群體中而無法被檢出。 PacBio無需擴增、對每一個單分子模板都進行評估，對于混合群體中低至 1/100的稀有突變都可以檢出。詳情

■ 公司動態

德國總理默克爾親自啟動第三代測序儀
 美國能源部聯合基因組實驗室購入PacBio取代454
PacBio正式發售第三代測序儀
 Pacific Biosciences：測序儀上市前的最后沖刺