Pacific Biosciences公司自今年4月底正式推出全球首個第三代測序平臺PacBioRS單分子實(shí)時測序系統(tǒng)后，一直致力于進(jìn)一步優(yōu)化其試劑的性能并努力開拓更多的應(yīng)用，據(jù)*新消息，其新版本的C2試劑將在今年年底或明年年初正式發(fā)布，C2試劑可使該系統(tǒng)的平均讀長從現(xiàn)在的1300bp提升至2700bp！基因有限公司作為Pacific Biosciences產(chǎn)品在中國大陸和香港地區(qū)的**授權(quán)經(jīng)銷商，將一如既往的秉承“Let Professionals Serve Professionals”的宗旨，為用戶提供更好、更便利、更專業(yè)的服務(wù)。

由Pacific Biosciences公司開發(fā)研制的革命性的單分子實(shí)時測序（SMRT^TM，Single Molecule, Real Time）技術(shù)在測序歷史上首次實(shí)現(xiàn)了人類觀測單個DNA聚合酶聚合過程的夢想。該技術(shù)通過光學(xué)方法直接記錄單個聚合酶在不受干擾的情況下的連續(xù)合成，其讀長之長，測序速度之快，靈活性之強(qiáng)大，已經(jīng)使許多極富挑戰(zhàn)性的基因組學(xué)研究成為可能。該系統(tǒng)可應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷、傳染病研究、衛(wèi)生防疫等多個領(lǐng)域。

目前，Pacific Biosciences公司已攜手基因有限公司，致力于開拓中國市場。基因有限公司憑借其遍及各大中城市的服務(wù)網(wǎng)絡(luò)以及包括銷售、市場和技術(shù)支持、售后服務(wù)等多個部門的完整的服務(wù)體系，將一如既往的為廣大用戶提供包括技術(shù)咨詢、產(chǎn)品選配、售后培訓(xùn)及維護(hù)的專業(yè)服務(wù)。

索取PacBioRS單分子實(shí)時測序系統(tǒng)的詳細(xì)資料

PacBioRS系統(tǒng)介紹：

PACBIO RS系統(tǒng)采用了SMRT測序技術(shù)，系統(tǒng)包含主機(jī)和用于數(shù)據(jù)存儲和運(yùn)算的Blade center。主機(jī)內(nèi)置的機(jī)械臂能夠自動將SMRT Cell在存儲區(qū)、準(zhǔn)備區(qū)以及測序區(qū)之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)自動化的單個或批量測序?qū)嶒?yàn)。系統(tǒng)的RS Touch觸摸屏實(shí)時顯示系統(tǒng)反饋信息，如系統(tǒng)的運(yùn)行狀態(tài)，每個 SMRT Cell 的制備過程，測序過程，堿基判定結(jié)果以及對應(yīng)Q值等，并實(shí)時播放測序過程中記錄的影片信息。系統(tǒng)的RS Remote遠(yuǎn)程監(jiān)控軟件，允許客戶遠(yuǎn)程設(shè)計(jì)和監(jiān)控測序過程并進(jìn)行初級數(shù)據(jù)分析。PACBIO RS系統(tǒng)的測序分析軟件包括SMRT Pipe、SMRT Portal和SMRT View三部分計(jì)算模塊，可與用戶的生物信息學(xué)平臺實(shí)現(xiàn)無縫整合，輕松實(shí)現(xiàn)測序數(shù)據(jù)瀏覽、數(shù)據(jù)過濾和比對、諸如單核苷酸多態(tài)性（SNP）等稀有突變的可視化篩查等數(shù)據(jù)分析操作。系統(tǒng)還自帶條形碼閱讀器，能夠提供樣品和試劑的信息，便于用戶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)管理。

SMRT^TM技術(shù)原理

3個核心創(chuàng)新技術(shù)的完美結(jié)合。
1. The SMRT Cell

測序在**的SMRT cell中進(jìn)行，每個SMRT cell含有150,000個ZMW（Zero-mode waveguide，零模波導(dǎo)孔）。

ZMW是直徑為幾十納米的小孔，被固定在玻璃基片表面的金屬薄膜上。由于ZMW的尺寸原因，可見光進(jìn)入ZMW后會迅速衰減，這樣當(dāng)用激光透過玻璃照射ZMW時，只有底部30nm左右的區(qū)域能被照亮。

DNA聚合酶同模板結(jié)合后，可通過**技術(shù)錨定在ZMW的底部玻璃表面，不同種類的核苷酸用不同顏色的熒光團(tuán)標(biāo)記，隨后核苷酸涌入ZMW中，并在陣列表面擴(kuò)散。當(dāng)聚合酶檢測到正確的核苷酸時，便將其摻入新生鏈中，這個過程需要幾毫秒，而單純的擴(kuò)散只需要幾微秒。這種時間差使摻入的核苷酸產(chǎn)生了很高的信號強(qiáng)度，因此，通過ZMW，可以在熒光標(biāo)記核苷酸的背景下檢測單個摻入事件。

2. Phospholinked nucleotides
將熒光染料標(biāo)記在核苷酸的磷酸鏈而不是堿基上，這樣，一旦核苷酸摻入到新生的DNA鏈中，標(biāo)記基團(tuán)就會自動脫落。

3. PacBioRS
能夠?qū)崟r監(jiān)測并分析單分子測序反應(yīng)。配備大孔徑物鏡和單光子照相機(jī)來收集熒光所發(fā)射的光脈沖，觀察整個過程；通過經(jīng)過優(yōu)化的算法，將光學(xué)系統(tǒng)所捕獲的熒光信號翻譯成堿基序列信息。一旦測序開始，實(shí)時的數(shù)據(jù)就傳送到系統(tǒng)的初級分析中心，在識別堿基“身份”的同時給出對應(yīng)的Q值。

PacBioRS的應(yīng)用進(jìn)展：

1）PacBioRS用于快速鑒定引起海地霍亂爆發(fā)的菌株來源

2010年10月，霍亂席卷了海地的10個省，還傳播到鄰國多米尼加。據(jù)海地衛(wèi)生部報(bào)告，93000人未能幸免，超過2100人在這場瘟疫中死亡。美國波士頓的研究人員采用PacBioRS對從海地暴發(fā)的霍亂中分離出的2株霍亂弧菌、1株來自1991年拉丁美洲發(fā)生霍亂的菌株和2002-2008年從南亞分離的2株菌種的基因組進(jìn)行了測序研究。利用早期的序列數(shù)據(jù)庫，研究人員對比了這5株菌和其他23株霍亂弧菌的基因組，從而對發(fā)生于海地的霍亂疫情可能的淵源做出了評定。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：海地霍亂菌株與2002年和2008年在孟加拉國分離得到的變異霍亂弧菌El Tor O1菌株之間關(guān)系密切。而與南美分離株的關(guān)系較遠(yuǎn)。

在該應(yīng)用中，研究人員在進(jìn)行霍亂弧菌的基因組拼接時，采用了雜交拼接（Hybrid Assembly）策略，分別將從疾控中心獲得的contigs和基于Illumina測序儀的短序列同PacBioRS上獲得的長序列進(jìn)行拼接，大幅減少了contigs數(shù)目，增加了N50長度。從而顯著提高了基因組拼接的效率。

2）PacBio RS在德國大腸桿菌疫情中一展身手

七月底在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志上發(fā)表了一篇名為“Origins of the E. coli Strain Causing an Outbreakof Hemolytic–Uremic Syndrome in Germany”的文章，該文對引起德國大腸桿菌疫情的高度致命性的細(xì)菌的病原性以及進(jìn)化起源提供了有價值的觀點(diǎn)。這篇文章描述了研究者們是如何在PacBioRS平臺上通過全球合作幾天內(nèi)就完成了對從疫情中獲得的大腸桿菌樣品以及近似菌株的測序和數(shù)據(jù)分析。PacBioRS的長讀長優(yōu)勢使得只使用PacBio RS數(shù)據(jù)完成de novo拼接成為可能，這對鑒定新的病原體來說也是一個極大優(yōu)勢。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果對于致病菌株提供了包括醫(yī)學(xué)信息在內(nèi)的迄今為止*詳細(xì)的遺傳“肖像”（Genetic profile）。

3）Expression Analysis發(fā)布其使用PacBio新的C2試劑的初步結(jié)果

Expression Analysis是美國著名基因組技術(shù)服務(wù)商，該公司可為用戶在Pacific Biosciences和Illumina平臺上提供測序服務(wù)。9月底，Pat Hurban（Expression Analysis負(fù)責(zé)研發(fā)的Vice President）在一次網(wǎng)絡(luò)會議中展示了其*新的PacBio數(shù)據(jù)。他們將大腸桿菌基因組DNA分別處理成2kb和6kb的片段，其中2kb的模板只用C1試劑進(jìn)行了測序，6kb的模板則分別用C1和C2試劑進(jìn)行了測序。Hurban對于使用C2試劑獲得的結(jié)果非常高興。他們發(fā)現(xiàn)使用C2試劑后，測序平均讀長提高了80%，可達(dá)到2700bp左右。

C2試劑第一次被使用是在德國大腸桿菌疫情研究中，研究人員通過將不同測序模式混合使用，*終獲得了2900bp的平均讀長以及99.998%的準(zhǔn)確度一致性。

Expression Analysis的研究團(tuán)隊(duì)在C2試劑的幫助下，獲得了2715bp的平均讀長，*長的讀長甚至達(dá)到了13091bp。和同樣模板使用C1試劑完成的數(shù)據(jù)比較后發(fā)現(xiàn)，C2試劑將測序平均讀長從1519bp提高了80%，*長讀長則從6512bp提高了一倍。

4）加拿大安大略癌癥研究所（OICR）正在使用PacBioRS對轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)的癌癥病人進(jìn)行靶向測序研究

OICR正在使用PacBio RS系統(tǒng)對19個已知癌癥基因進(jìn)行測序，位于多倫多的Princess Margaret醫(yī)院的CLIA實(shí)驗(yàn)室則用Sequenom的OncoCarta panel對OICR的測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

OICR癌癥基因項(xiàng)目的負(fù)責(zé)人John McPherson表示，他們的目標(biāo)是驗(yàn)證PacBioRS系統(tǒng)并且試圖建立起一套對癌癥病人的測序體系，這樣可以幫助醫(yī)生獲取更多信息從而做出更恰當(dāng)?shù)闹委煕Q定或者臨床試驗(yàn)安排。OICR希望*終能將這套體系應(yīng)用于對癌癥病人的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理流程中。

目前，該小組已經(jīng)完成了15個病人的測序，其中一半的病人19個基因中至少有1個發(fā)生了突變。PacBioRS沒有錯過任何一個OncoCarta試劑盒檢出的突變，并且，還發(fā)現(xiàn)了一個新的突變。“這就是我們?yōu)槭裁匆�做測序，我們希望能發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的檢測試劑盒未涵蓋的信息”McPherson說。

目前該項(xiàng)目的周轉(zhuǎn)時間為3周，整個流程包括：病人簽署同意書，組織活檢、DNA抽提、測序、分析、驗(yàn)證以及同臨床醫(yī)生和研究人員開會給出相關(guān)報(bào)告。由于周轉(zhuǎn)時間的限制，PacBioRS的測序完成速度也是McPherson的研究小組選擇它的一個主要原因。

McPherson表示他們從PacBio上獲得的結(jié)果非常好，平均讀長大概在1800bp，研究人員使用環(huán)形比對測序模式來確保測序的準(zhǔn)確性并且獲得了是擴(kuò)增子數(shù)百倍覆蓋深度的測序數(shù)據(jù)。

5）*新發(fā)布“靶向重測序—EGFR-MET基因”的技術(shù)文獻(xiàn)

核心內(nèi)容：
Fluidigm Access Array系統(tǒng)同PacBioRS的兼容性已經(jīng)被證實(shí)，相應(yīng)的靶向富集策略流程也已公布。

標(biāo)準(zhǔn)測序模式和環(huán)形比對測序模式都可以用于檢測SNP。標(biāo)準(zhǔn)測序模式的優(yōu)點(diǎn)在于既可以維持完整的讀長且并不會對SNP的檢測造成影響。

參考文獻(xiàn)：
1) The Origin of the Haitian Cholera Outbreak Strain，December 9, 2010，The New England Journal of Medicine.
Authors: Chen-Shan Chin, Ph.D., Jon Sorenson, Ph.D., Jason B. Harris, M.D., William P. Robins, Ph.D., Richelle C. Charles, M.D., Roger R. Jean-Charles, M.D., James Bullard, Ph.D., Dale R. Webster, Ph.D., Andrew Kasarskis, Ph.D., Paul Peluso, Ph.D., Ellen E. Paxinos, Ph.D., Yoshiharu Yamaichi, Ph.D., Stephen B. Calderwood, M.D., John J. Mekalanos, Ph.D., Eric E. Schadt, Ph.D., and Matthew K. Waldor, M.D., Ph.D.

2) Origins of the E. coli Strain Causing an Outbreak of Hemolytic–Uremic Syndrome in Germany,July 27, 2011,The New England Journal of Medicine.
Authors: David A. Rasko, Ph.D., Dale R. Webster, Ph.D., Jason W. Sahl, Ph.D., Ali Bashir, Ph.D., Nadia Boisen, Ph.D., FlemmingScheutz, Ph.D., Ellen E. Paxinos, Ph.D., Robert Sebra, Ph.D., Chen-Shan Chin, Ph.D., Dimitris Iliopoulos, Ph.D., Aaron Klammer, Ph.D., Paul Peluso, Ph.D., Lawrence Lee, Ph.D., Andrey O. Kislyuk, Ph.D., James Bullard, Ph.D., Andrew Kasarskis, Ph.D., Susanna Wang, B.S., John Eid, Ph.D., David Rank, Ph.D., Julia C. Redman, Ph.D., Susan R. Steyert, Ph.D., JakobFrimodt-Møller, B.S., Carsten Struve, Ph.D., Andreas M. Petersen, Ph.D., Karen A. Krogfelt, Ph.D., James P. Nataro, M.D., Ph.D., M.B.A., Eric E. Schadt, Ph.D., and Matthew K. Waldor, M.D., Ph.D.