眾所周知，天然的DNA復(fù)制本身就是一個(gè)非常高效且準(zhǔn)確的過(guò)程。真核生物DNA復(fù)制的速度達(dá)幾十個(gè)核苷酸/秒。若能以這樣的神速測(cè)序，那可比Sanger測(cè)序快了幾萬(wàn)倍。然而，知易行難。如何在不影響聚合酶活性的前提下實(shí)時(shí)觀察DNA合成，這可是個(gè)棘手的問(wèn)題。要知道，DNA聚合酶的直徑只有15 nm。而且，這是一個(gè)涉及酶學(xué)、表面化學(xué)和檢測(cè)光學(xué)的多學(xué)科難題。

早在10多年前，美國(guó)康奈爾大學(xué)的研究生Steven Turner和Jonas Korlach就開始為解決這一難題而做出不斷努力。如今，Korlach和Turner創(chuàng)辦了一家名為Pacific Biosciences（以下簡(jiǎn)稱PacBio）的公司，并且終于將他們的想法轉(zhuǎn)變成為現(xiàn)實(shí)產(chǎn)品。讓我們看看他們主要克服了哪些挑戰(zhàn)。

實(shí)時(shí)觀察DNA聚合酶的主要挑戰(zhàn)之一是如何能在DNA合成期間檢測(cè)到單個(gè)核苷酸的摻入。因?yàn)樵陲@微鏡實(shí)時(shí)記錄DNA鏈上熒光的時(shí)候，周圍眾多的熒光標(biāo)記的核苷酸形成了非常強(qiáng)大的熒光背景。這種強(qiáng)大的熒光背景使單分子的熒光探測(cè)成為不可能。正在他們一籌莫展之際，突然，微波爐門給了他們啟發(fā)。微波爐門上的金屬篩布滿了小洞，它們比微波的波長(zhǎng)要小得多。因此，這些洞能阻止微波通過(guò)并穿透玻璃。然而，波長(zhǎng)更小的可見光就能夠通過(guò)，讓我們看到食物。他們的SMRT技術(shù)應(yīng)用了相同的原理，不過(guò)規(guī)格就縮小至納米級(jí)，稱之為ZMW（zero-mode waveguide，零模式波導(dǎo)）。

ZMW是一個(gè)直徑為幾十納米的小孔，它阻止可見的激光（波長(zhǎng)大約為600 nm）完全透過(guò)ZMW。激光在進(jìn)入ZMW后迅速衰減，因此，只有底部30 nm被照亮（下圖）。在每個(gè)ZMW中，單個(gè)DNA聚合酶分子利用專利技術(shù)錨定在底部玻璃的表面。隨后核苷酸涌入ZMW中，并在陣列表面擴(kuò)散。當(dāng)聚合酶檢測(cè)到正確的核苷酸時(shí)，便將其摻入新生鏈中，這個(gè)過(guò)程需要幾毫秒，而單純的擴(kuò)散只需要幾微秒。這種時(shí)間差使摻入的核苷酸產(chǎn)生了很高的信號(hào)強(qiáng)度，類似于脈沖信號(hào)。因此，ZMW有能力在熒光標(biāo)記核苷酸的背景下檢測(cè)單個(gè)摻入事件。

測(cè)序是在專利的SMRT Cell中開展的，每個(gè)Cell中有一個(gè)陣列，上面有15萬(wàn)個(gè)ZMW。每個(gè)ZMW都能夠包含一個(gè)DNA聚合酶及一條不同的DNA樣品鏈。每次運(yùn)行能夠平行檢測(cè)大約75,000個(gè)單分子測(cè)序反應(yīng)。

Korlach與Turner還有一項(xiàng)重大發(fā)明。傳統(tǒng)的核苷酸標(biāo)記方法是將熒光標(biāo)記連接到核苷酸的堿基上，也就是摻入DNA鏈中。這對(duì)于實(shí)時(shí)觀察DNA合成也是有問(wèn)題的，因?yàn)榇蠓肿拥娜玖蠒?huì)干擾DNA聚合酶的活性，或造成聚合反應(yīng)提前終止。因此，Korlach和Turner就開發(fā)出一種新型的核苷酸標(biāo)記方法，即在核苷酸的磷酸鏈上進(jìn)行標(biāo)記，而不是堿基，這樣，一旦核苷酸摻入到新生DNA鏈中，標(biāo)記基團(tuán)就會(huì)自動(dòng)脫落。

當(dāng)然，要將ZMW中的反應(yīng)記錄下來(lái)，還需要一臺(tái)高精尖的儀器。PacBio RS于是誕生了，它能夠?qū)崟r(shí)開展、監(jiān)控并分析單分子生化反應(yīng)。PacBio RS使用一個(gè)大孔徑物鏡和四個(gè)單光子照相機(jī)來(lái)收集熒光所發(fā)射的光脈沖，觀察整個(gè)過(guò)程；并使用一套優(yōu)化的算法，將光學(xué)系統(tǒng)所捕獲的信息翻譯成ACGT堿基。一旦測(cè)序開始，實(shí)時(shí)的數(shù)據(jù)就傳送到初步分析流水線，生成堿基身份和質(zhì)量值。

以上三種新技術(shù)結(jié)合，就能讓研究人員在短短的幾分鐘內(nèi)對(duì)長(zhǎng)片段DNA進(jìn)行測(cè)序。它的速度、讀長(zhǎng)、靈活性和費(fèi)用讓其從第三代測(cè)序中脫穎而出。從樣本制備到測(cè)序，所需的時(shí)間還不到一天。典型的測(cè)序運(yùn)行時(shí)間低至30分鐘。序列數(shù)據(jù)在幾分鐘之內(nèi)就能產(chǎn)生，而不是幾天，這對(duì)于傳染病監(jiān)控和分子病理學(xué)尤為重要。PacBio RS目前的讀長(zhǎng)超過(guò)1kb，比第二代測(cè)序要長(zhǎng)得多。此外，試劑消耗和樣本制備極少，不需要常規(guī)的PCR擴(kuò)增，失誤也大大減少，聚合酶動(dòng)力學(xué)的直接觀察賦予了測(cè)序之外的更多應(yīng)用。憑借這些優(yōu)勢(shì)，PacBio今年被美國(guó)麻省理工學(xué)院（MIT）的《技術(shù)評(píng)論》（Technology Review）雜志評(píng)為全球50家最具創(chuàng)新力的企業(yè)之一。

一系列的文章也證明了SMRT技術(shù)。Korlach與Turner于2009年2月在《科學(xué)》雜志上發(fā)表了一篇介紹PacBio單分子DNA測(cè)序技術(shù)的文章。這篇文章代表了首個(gè)第三代測(cè)序技術(shù)的“原理驗(yàn)證”，因此引用率非常高。而后，他們又利用SMRT技術(shù)，直接測(cè)定了DNA的甲基化，這相對(duì)目前流行的第二代測(cè)序技術(shù)又前進(jìn)了一大步。文章發(fā)表在今年5月的《Nature Methods》上。

熒光脈沖的到達(dá)時(shí)間和持續(xù)時(shí)間反映了有關(guān)聚合酶動(dòng)力學(xué)的信息，從而允許直接檢測(cè)DNA模板鏈中的修飾核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶。各種修飾對(duì)聚合酶動(dòng)力學(xué)的影響不一，從而能夠?qū)⑺鼈儏^(qū)分開。研究人員使用這些動(dòng)力學(xué)特征，鑒定出基因組樣品中的腺嘌呤甲基化，并發(fā)現(xiàn)再結(jié)合circular consensus sequencing，他們能夠在單堿基分辨率上鑒定出表觀遺傳學(xué)修飾（mA、mC和hmC）。研究人員還預(yù)計(jì)，其它的表觀遺傳學(xué)修飾，以及各種形式的DNA傷害，也能用這種方法檢測(cè)。

看到這里，大家可能迫不及待地想知道PacBio的測(cè)序儀何時(shí)上市，價(jià)格多少。其實(shí)，PacBio RS已成型，目前正在早期試用階段。今年2月份，PacBio宣布了10位北美的早期試用客戶，包括貝勒醫(yī)學(xué)院、冷泉港實(shí)驗(yàn)室、美國(guó)能源部聯(lián)合基因組研究所、華盛頓大學(xué)基因組中心和斯坦福大學(xué)等等，并與第二季度開始發(fā)貨。8月份，PacBio又迎來(lái)了它的首位歐洲試用客戶，大名鼎鼎的Wellcome Trust Sanger研究院。

整個(gè)測(cè)序系統(tǒng)包括PacBio RS儀器以及專利的耗材。耗材部分包括SMRT Cell和試劑盒。PacBio RS上的每個(gè)反應(yīng)消耗一個(gè)SMRT Cell。8個(gè)SMRT Cell包裝成8Pac的形式。另外，他們還提供了三種試劑盒，用途各不同。Template Preparation Kit將DNA轉(zhuǎn)化成SMRTbell文庫(kù)形式。Binding Kit則將這個(gè)文庫(kù)與聚合酶結(jié)合，為測(cè)序做準(zhǔn)備。Sequencing Kit包含了實(shí)時(shí)測(cè)序所需的試劑。每個(gè)樣本可在單個(gè)SMRT Cell上測(cè)序，也可根據(jù)項(xiàng)目需求在多個(gè)SMRT Cell中測(cè)序。因此，每個(gè)反應(yīng)的價(jià)格取決于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

PacBio預(yù)計(jì)，到2013年，個(gè)人基因組的測(cè)序能在15分鐘內(nèi)完成，費(fèi)用低于1000美元，人人都可以消費(fèi)得起。說(shuō)實(shí)話，2008年我第一次聽到這個(gè)消息時(shí)，心中飽存疑惑，看來(lái)我實(shí)在是低估了PacBio的實(shí)力，也低估了測(cè)序技術(shù)發(fā)展的腳步。（生物通 余亮）