在上一篇文章《RNA甲基化修飾——m6A概念》中，我們回顧了RNA上的堿基修飾，尤其是m6A甲基化修飾的一些基礎知識。由Writers、Erasers和Readers參與調控m6A這種可逆的甲基化修飾，與許多重要的生物學功能息息相關。那么今天我們就來聊一聊如何檢測m6A甲基化，尤其是借助近幾年興起的高通量測序技術。

截止2017年已發表的論文中，m6A的檢測方法五花八門。實際上，上世紀70年代，科學家已經在RNA中發現了m6A這種甲基化修飾。只不過受限于檢測條件和工具，相關研究并沒有大范圍展開。何川教授在其2014年發表于Nature Reviews Genetics上的一篇綜述曾寫到“Genome-wide distribution of m6A was unknown before 2012”。

2012年之后，兩篇發表于Nature和Cell上的論文可以說是第一次從轉錄水平上，大范圍高通量地鑒定了人和小鼠m6A的甲基化水平（Dominissini 2012和Meyer 2012）。這兩篇獨立發表的論文采用的核心方法就是將m6A抗體與帶有m6A的mRNA片段相結合后進行高通量測序。通過對下機數據的分析，來鑒定mRNA上m6A程度較高的區域，分辨率約為100nt。這種方法我們稱之為MeRIP-seq或m6A-seq。

2015年后，部分科學家將m6A的分辨率精確到單堿基的程度，包括miCLIP-seq以及SCARLET等（Linder 2015和Fu 2014）。這類方法雖然可以鑒定到單堿基甲基化水平，由于實驗方法中涉及P32等同位素標記加上成本過高，常規實驗室不會特意展開此類實驗。

本文主要對MeRIP-seq這項技術的原理做一個簡述，方便大家理解如何對m6A區域進行富集和鑒定。文末我們還會對一些實驗中比較“坑爹”的雷區，展開討論。備注部分將會詳細討論可能出現問題的一些環節，這個部分需要重點關注。

MeRIP-seq建庫步驟：

1. 提取total RNAs，并用Oligo-dT磁珠對total RNAs帶有polyA的mRNA進行富集（備注1）。

2. 對磁珠進行富集，得到帶有polyA的mRNA。之后加入片段化試劑，將完整的mRNA進行片段化。或者使用超聲波儀直接進行片段化（備注2）。

3. 將片段化后的RNA分成兩份。一份加入帶有m6A抗體的免疫磁珠，對含有m6A甲基化的mRNA片段進行富集（備注3）。另一份作為control，直接構建常規的轉錄組測序文庫。

4. 對m6A抗體免疫磁珠進行富集，帶有m6A的mRNA片段進行回收后，按照轉錄組的建庫流程構建常規的測序文庫。

 圖1 m6A甲基化富集建庫流程示意圖 Fu, Y et al (2014) Nature Reviews Genetics, 15(5): 293

5. 分別將構建好的2個測序文庫，即m6A-seq library和RNA-seq library分別進行高通量測序。測序平臺盡量保持一致，推薦illumina的Hiseq 2500以上平臺，如illumina Hiseq 4000, X ten, Noveseq等。

6. 對下機數據進行生物信息學分析，對發生m6A甲基化程度較高的區域進行peak calling。由于不能做到單個堿基的分辨率，所以只能對大致的區域進行分析。從圖2中我們可以發現，與右側常規的轉錄組測序結果相比，在基因上有2處區域存在非常明顯的高甲基化峰。

 圖2 m6A甲基化peak calling region標準分析

7. 接下來我們會對mRNA上具體區域內甲基化程度進行高級分析，從圖3中我們可以發現，在mRNA的5’起始位置，以及3’終止密碼子區域存在高甲基化現象。

 圖3 m6A 甲基化peak calling region 高級分析

以上就是關于m6A-seq的標準步驟，現在是不是對m6A-seq有一個非常直觀的認識呢？！再次強調下，這種測序方法只能鑒定高甲基化的區域，并不能做到單堿基的分辨率。下面我們一起來看一看備注，到底這個實驗會出現哪些“坑爹”的細節呢。

備注1：Total RNA的起始量前期建議在600-800ug以上。由于這個實驗對于RNA純度要求較高，建議老師在送樣的時候多送一些，細胞數量最低建議在10⁸甚至是10⁹以上（大約8板）。肝臟和大腦等轉錄水平較為活躍的組織也是最優選擇之一。mRNA在Total RNA中的比例約為2~4%，最后得到帶有polyA的mRNA含量估計約在10ug到35ug之間。磁珠富集純化這一步也會有一定的損失率，所以最后用于下一步實驗所需的RNA理論上還會繼續有所下降。血清等特殊樣本目前仍然存在很大的技術難度。

備注2：這里對mRNA進行片段化之前有兩種選擇。既可以對mRNA進行回收后進行片段化，也可以直接對帶有磁珠的polyA  mRNA進行片段化。片段化試劑盒和超聲波儀都是可行的。理論上由于超聲波儀采用共振的方式，最后回收的片段長度較為均一。而片段化試劑產生的片段大小不一，在第一步的基礎上RNA繼續有所損耗。

備注3：這個步驟是整個實驗的難點所在，抗體免疫磁珠去抓取帶有m6A的mRNA片段也是有一定效率和比例的，如果操作稍有不慎或者一些細節性的東西沒有注意，片段化程度、抗體的抓取效率等細節都會直接影響到后期的實驗結果。

下面我們再把前面的步驟合到一起，再來帶大家回顧一下m6A-seq從建庫到分析的步驟，詳見圖4。

 圖4 完整的m6A-seq/MeRIP-seq建庫實驗加分析步驟流程圖

講完了m6A-seq，我們再來稍微講一講可以做到單堿基分辨率的miCLIP，具體流程如圖5所示。簡單地說，前面的步驟類似，接下來3’端會連上接頭，5’端會進行P32標記。同位素標記的目的是在于，轉膜后抗體-RNA復合物在切膜回收的時候能夠更加精確獲得自己想要的甲基化片段。如圖6所示，虛線標記的位置就是我們要切膜回收的區域。當然，同位素實驗過于危險，理論上這一步也可以不加同位素標記，但是準確率會有所降低。

圖5 miCLIP建庫流程

 圖6 miCLIP切膜回收區域

接下來我們會對回收的片段進行反轉錄，當某個位點發生甲基化時，反轉錄會有一定的幾率停止反應。最后對片段進行環化，圖5中綠色的部分一旦“讀取”完畢，第一個堿基就是我們要的甲基化位點。

今天的m6A甲基化檢測專題到這里就結束了。很多老師和同學更關心的是如何將m6A甲基化和自己研究的課題結合起來，我們下一期專題中會進行重點講解。那實驗設計沒思路怎么辦？沒關系，請大家期待下一期的m6A甲基化專題——m6A案例剖析與實驗設計思路講解。

參考文獻：
1. Fu, Y., Dan, D., Rechavi, G., & He, C. "Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation." Nature Reviews Genetics 15.5 (2014):293-306.
2. Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T., & He, C. "Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation." Cell 169.7 (2017):1187.
3. Dan, Dominissini, et al. "Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq." Nature 485.7397 (2012):201-6.
4. Meyer, Kated., et al. "Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3′ UTRs and near Stop Codons." Cell 149.7 (2012):1635.
5. Linder, Bastian, et al. "Single-nucleotide resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome." Nature Methods 12.8 (2015):767.
6. Helm, M, & Y. Motorin. "Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate.” Nature Reviews Genetics 18.5 (2017):275.