最近關于m6A甲基化的研究，熱度持續不減。早在2015年就已經在《Nature》和《Cell》上發表了相關研究。那么下面我們就來了解一下這期的主角——m6A甲基化。

已知RNA存在超過100種修飾。在真核生物中，5’端的Cap以及3’的ployA修飾在轉錄調控中起到了十分重要的作用，而mRNA的內部修飾則用于維持mRNA的穩定性。mRNA最常見的內部修飾包括N6-腺苷酸甲基化（m6A）、N1-腺苷酸甲基化（m1A）、胞嘧啶羥基化（m5C）等。對于大熱的m6A，截至2017年，全球的科學家已經鑒定了參與m6A的許多酶，包括去甲基化酶、甲基化酶和甲基化識別酶等。芝加哥大學的何川教授對此貢獻巨大。來自中科院北京基因組研究所的楊運桂研究員也是這方面的大牛。

一旦參與m6A修飾的酶出現異常將會引起一系列疾病，包括腫瘤、神經性疾病、胚胎發育遲緩等。此外，一些非編碼RNA如lncRNA、tRNA、rRNA以及剪切體RNA在轉錄前后，也存在大量的堿基修飾活動。雖然近幾年，關于RNA修飾的研究數量開始增多并慢慢成形，一些深入性的機制研究仍有大量的工作待全球的科學家去完成。但是無論如何，coding RNAs和non-coding RNAs上發生的動態修飾代表了一種全新的遺傳信息調控方式。

早在上世紀60年代，除了傳統的ACGU四種堿基外，Cohn等人已經在RNA上發現了大量的堿基位點修飾。Holley等人于1965年，首次在酵母的tRNA中鑒定了包括假尿苷（pseudouridine）在內的十余種不同的RNA修飾。已知絕大部分真核生物中，mRNA在5’ Cap處存在甲基化修飾，作用包括維持mRNA穩定性、mRNA前體剪切、多腺苷酸化、mRNA運輸與翻譯起始等。而3’ polyA發生的修飾有助于出核轉運、翻譯起始以及與polyA結合蛋白一起維持mRNA的結構穩定。

圖1 真核生物mRNA上存在的各種堿基修飾行為，在5’和3’的UTR以及中間的coding region都有堿基發生修飾。
Roundtree et al (2017) Cell, 169 [15]: 1187-1200

但是這些修飾只發生mRNA的頭部和尾部，關于RNA的內部修飾（internal modification）在許多種類的RNA中都有發生。無論是mRNA還是lncRNA，都大量存在m6A修飾。m6A能夠加速mRNA前體的加工時間，加快mRNA在細胞中的轉運速度和出核速度。除了m6A，RNA上還存在以下常見的幾種修飾，包括m1A，m5C等（圖1）。

已知tRNA上發生堿基修飾的比例較高，會有各種各樣的堿基修飾行為。tRNA修飾有助于提高翻譯效率，維持其三葉草折疊二級結構的穩定性。人類的核糖體RNA（rRNA）上有超過200個堿基修飾位點，而剪切體RNA（spliceosomal RNA）上也有超過50個堿基修飾位點。

雖然RNA甲基化的研究在上世紀七十年代就開始，但是由于技術上的局限一直停滯不前。直到最近幾年在何川教授等研究團隊的帶領下，通過不斷的技術創新和難點攻克，m6A 等甲基化修飾的研究才不斷取得突破性的進展。

隨著分析化學工具的升級以及高通量測序技術的興起，研究RNA修飾的方法變得越來越便捷。強大的工具是研究工作的前提保證。伴隨NGS的發展，表觀轉錄組學誕生了，其中大熱的主角就是腺苷酸甲基化，包括m6A和m1A等。那么下面我們就要來講一講這期的主角m6A。

 圖2 N6-甲基化腺苷酸結構示意圖 Roundtree et al (2017) Cell, 169 [15]: 1187-1200

我們先來了解下什么叫m6A修飾。從圖2中我們可以看到，這是一個已經發生甲基化的核糖核苷酸，確切地說叫N6-methyladenosine。一共分為2個大的結構。我們先來回顧下基礎生物化學知識。左下角的是五碳糖，圖2中a框部分也就是五碳糖的第二位C處的羥基發生脫氧就會變成脫氧核糖核苷酸（從RNA變成DNA）。圖2中c框部分標注的，也就是第四位的C處通常會帶有磷酸基，如果此處帶有2個磷酸基團那么就叫ADP，如果帶有3個磷酸基團那就是大名鼎鼎的ATP了。圖2中b框部分通常就是我們所說的含氮堿基。這里特指腺苷酸（A），當腺苷酸的第六位N處發生甲基化時，就是我們所說的m6A。

 圖3 （左）腺苷酸甲基化和去甲基化的過程（Roundtree et al (2017) Cell, 169: 1187）；
 （右） m6A甲基化酶consensus motif（Fu, Y et al (2014) Nature Reviews Genetics, 15(5): 293）

從圖3左中我們可以看到，當從DNA→RNA過程中，腺苷酸在甲基化酶METTL3、METTL14和WTAP等作用下在第六位N發生了甲基化修飾。這類酶我們稱之為Writers，其中METTL3和METTL14形成雜絡物（hetero complex），與WTAP（也叫做Fl(2)d）及其他factors如KIAA1429（也叫做Virilizer）一起對腺苷酸進行修飾。另外Writers酶還包括釀酒酵母中的Ime4等。

接下來這些已經發生m6A修飾的堿基，在FTO和ALKBH這兩種酶的作用下發生去甲基化。其中FTO就是臭名昭著的Fat mass and obesity-associated protein，其詳細的分子機制在2007年的小鼠模型上做過比較系統的研究。該酶與ALKBH5一起，使得RNA甲基化成為一種可逆的反應。

最后這些發生甲基化修飾的RNA堿基位點，需要特定的酶來識別。這時候就需要咱們的readers登場了。已知YTHDF家族包括YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3以及釀酒酵母中的Mrb1基因、粟酒裂殖酵母中的Mmi1基因都是readers類蛋白。這些酶能夠識別發生m6A甲基化的堿基，參與下游翻譯、mRNA降解、加快mRNA出核速度等作用。如圖4C中所示，YTHDF2參與mRNA降解過程。

圖4 m6A分子途徑和細胞功能（Mihye Lee et al (2014) Cell, 158: 980）

好了，讓我們再來系統地回顧一下，參加m6A甲基化的酶到底有哪幾類。從圖4B中，我們可以看到RNA的m6A甲基化一共有大三類酶參與：Writers、Erasers和Readers，具體信息如下表所示。

今天的RNA甲基化小課堂就講到這里了，下一期我們會講一講如何檢測RNA甲基化，尤其是使用高通量測序的手段檢測m6A這種類型的RNA甲基化修飾。敬請期待RNA甲基化修飾（2）——如何檢測m6A。

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參考文獻
1. Fu, Y., Dan, D., Rechavi, G., & He, C*. "Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation." Nature Reviews Genetics 15.5 (2014):293-306.
2. Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T., & He, C*. "Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation." Cell 169.7 (2017):1187.
3. Cantara, William A., et al. "The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update." Nucleic Acids Research 39.Database issue(2011):D195.
4. Lee, M., B. Kim, & A. V. N. Kim*. "Review: Emerging Roles of RNA Modification: m6A and U-Tail." Cell 158.5 (2014):980.
5. Cohn, W. E*. "Pseudouridine, a carbon-carbon linked ribonucleoside in ribonucleic acids: isolation, structure, and chemical characteristics." Journal of Biological Chemistry 235.235 (1960):1488.
6. Holley, R. W., Everett, G. A., Madison, J. T., & Zamir, A*. "NUCLEOTIDE SEQUENCES IN THE YEAST ALANINE TRANSFER RIBONUCLEIC ACID." Journal of Biological Chemistry 240 (1965):2122.
7. Alarcón,  C. R., et al. "HNRNPA2B1 Is a Mediator of m(6)A-Dependent Nuclear RNA Processing Events. " Cell 162.6 (2015):1299-1308.
8. Alarcón, C. R., et al. "N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing." Nature 519.7544(2015):482.