生物通報(bào)道   來(lái)自哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員開(kāi)發(fā)出了一種預(yù)測(cè)軟件，可以準(zhǔn)確找出最有效的方法利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)基因打靶。這項(xiàng)重要的研究成果發(fā)布在《自然方法》（Nature methods）雜志上。

領(lǐng)導(dǎo)這一研究小組的是哈佛醫(yī)學(xué)院著名遺傳學(xué)教授、Wyss研究所的核心成員George Church。他被譽(yù)為是個(gè)人基因組學(xué)和合成生物學(xué)的先鋒。1984年，Church和WalterGilbert發(fā)表了首個(gè)直接基因組測(cè)序方法，該文章中的一些策略現(xiàn)在仍應(yīng)用在二代測(cè)序技術(shù)中。此外，如今的多重化分子技術(shù)和條碼式標(biāo)簽也是他發(fā)明的。Church還是納米孔測(cè)序技術(shù)的發(fā)明者之一。

利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)科學(xué)家們可以非常容易及準(zhǔn)確地改變基因組，這為通過(guò)遺傳工程來(lái)改善人類健康及環(huán)境帶來(lái)了新希望。Cas9是一種存在于某些細(xì)菌中的天然蛋白，它可以像一對(duì)分子剪刀一樣精確地切割DNA片段，是一種極其有效的基因編輯工具。借助于一段匹配的向?qū)�RNA（guide RNA）序列可以將Cas9引導(dǎo)至特異的基因處誘導(dǎo)基因突變，使得科學(xué)家們可以編程控制基因編輯。

盡管Cas9可以精確地完成這些功能，然而可能會(huì)有不止一條向?qū)�RNA可以與指定的靶基因匹配，因而研究人員一開(kāi)始便面對(duì)著一項(xiàng)排查工作：為指定的基因編輯任務(wù)選擇出最佳的向?qū)�RNA。

為了繞過(guò)這一選擇向?qū)�RNA的試錯(cuò)過(guò)程，研究小組開(kāi)發(fā)出了一種簡(jiǎn)單的新軟件程序，用來(lái)預(yù)測(cè)可將Cas9引導(dǎo)至靶基因處的最佳向?qū)�RNAs。

不同于科學(xué)家們當(dāng)前使用的其他基因靶向算法，這一軟件是基于利用人類基因組收集的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分級(jí)排列任何給定向?qū)�RNA靶向目標(biāo)靶基因的效率。

“這將普遍提高科學(xué)家們選擇出適當(dāng)向?qū)�RNA的速度和準(zhǔn)確性，從而達(dá)到他們期望的基因編輯結(jié)果，”Church說(shuō)。

現(xiàn)在Church研究小組不僅公開(kāi)了當(dāng)前最常用的Cas9細(xì)菌源——化膿性鏈球菌（S. pyogenes ）的Cas9的有效向?qū)�RNAs信息，還提供了越來(lái)越普遍使用的另一種細(xì)菌物種——嗜熱鏈球菌（S. thermophilus）最全面的向?qū)�RNA文庫(kù)（延伸閱讀：Nature發(fā)布CRISPR-Cas9重大新成果）。

為了開(kāi)發(fā)出作為新軟件基礎(chǔ)的這一算法，Church研究小組高通量分析了許多靶基因和互補(bǔ)向?qū)�RNAs之間的活性，搜索了向?qū)�RNA序列的模式——這可以表明它們結(jié)合指定靶基因的效率。

為此，他們從每個(gè)靶基因中挑選出了一段獨(dú)特的序列，合成出一段完全相同的DNA來(lái)代表靶基因，隨后他們構(gòu)建出了一個(gè)極大的DNA文庫(kù)，將它儲(chǔ)存在細(xì)胞質(zhì)粒中。利用一種病毒作為傳送載體，他們隨后將這一文庫(kù)傳送到了培養(yǎng)細(xì)胞基因組中。為了測(cè)試出可以最有效抵達(dá)獨(dú)特靶基因處的向?qū)�RNAs，研究人員將互補(bǔ)的向?qū)�RNA與Cas9一起插入到細(xì)胞中，使得Cas9有機(jī)會(huì)在成功匹配的位點(diǎn)生成基因組突變。隨后的基因組提取及測(cè)序過(guò)程輕易地揭示出了與每個(gè)靶基因最佳匹配的向?qū)�RNA。

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基于這些數(shù)據(jù)，研究小組開(kāi)發(fā)出了他們的新算法，并對(duì)靶向幾乎所有人類基因的最有效向?qū)�RNAs進(jìn)行了排序和評(píng)分。

研究的主要作者、哈佛醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)研究人員Raj Chari說(shuō)：“通過(guò)分析我們的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了向?qū)�RNA序列的一些特征，這些特征表明了它們可在多大程度上將Cas9引導(dǎo)至目標(biāo)靶基因。通過(guò)基于這些特征設(shè)計(jì)出一種算法，我們現(xiàn)在可以檢測(cè)任何的向?qū)�RNA序列，打出分?jǐn)?shù)來(lái)預(yù)計(jì)它的效率。”

通過(guò)加速基因編輯過(guò)程這部分的工作，科學(xué)家們可以將主要精力放到應(yīng)用Cas9基因編輯，開(kāi)發(fā)出一些基因療法來(lái)對(duì)抗諸如鐮狀細(xì)胞貧血、癌癥或艾滋病等疾病上，或是構(gòu)建出遺傳工程生物幫助清理環(huán)境，或是執(zhí)行其他的功能，例如持續(xù)地生成化學(xué)產(chǎn)品。

“對(duì)于所有在日常工作中使用RNA導(dǎo)向Cas9的科學(xué)家們而言，獲得這樣的一種工具將讓他們大大獲益，可迅速地縮小最有效引導(dǎo)Cas9到目的基因處去的向?qū)�RNA的范圍，”Chari說(shuō)。

（生物通：何嬙）

生物通推薦原文摘要：

Unraveling CRISPR-Cas9 genome engineering parameters via a library-on-library approach

We developed an in vivo library-on-library methodology to simultaneously assess single guide RNA (sgRNA) activity across ~1,400 genomic loci. Assaying across multiple human cell types and end-processing enzymes as well as two Cas9 orthologs, we unraveled underlying nucleotide sequence and epigenetic parameters. Our results and software (http://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorer) enable improved design of reagents, shed light on mechanisms of genome targeting, and provide a generalizable framework to study nucleic acid–nucleic acid interactions and biochemistry in high throughput.