生物通報道：基因組測序讓我們意識到，人類基因組只有一小部分被翻譯成蛋白質(zhì)。其實我們基因組的80%會轉(zhuǎn)錄成RNA，但這些轉(zhuǎn)錄本大多不生成蛋白質(zhì)。近年來人們發(fā)現(xiàn)非編碼RNA往往與人類疾病有關(guān)，不過絕大多數(shù)非編碼RNA的功能還是未知的。

CRISPR/Cas9在這方面可以起到重要的作用。這一系統(tǒng)原本是細菌在漫長進化史中演化出的防御機制，能根據(jù)引導(dǎo)RNA的指示，靶標并降解入侵者的遺傳物質(zhì)。規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)CRISPR與內(nèi)切酶Cas9的組合，可以在引導(dǎo)RNA的指引下，靶標并切割入侵者的遺傳物質(zhì)。2012年研究者們利用這一特點，將CRISPR系統(tǒng)發(fā)展成了強大的基因組編輯工具。

CRISPR/Cas9很快迎來了進一步的改造。研究者們將Cas9帶到特定的基因組位點，通過起始或停止轉(zhuǎn)錄來調(diào)控靶基因的表達。CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR抑制（CRISPRi）就是這樣的技術(shù)，它們特別適合分析非編碼RNA的具體功能。雖然越來越多的研究人員開始使用CRISPRa和CRISPRi，但它們其實還剛出爐不久。“我們都是這些技術(shù)的測試員，”加州大學的Jacob Corn說。

為此，The Scientist雜志聯(lián)合CRISPR的開發(fā)者和使用者共同編寫了使用CRISPRa和CRISPRi的入門指南，幫助研究者們更好的研究和調(diào)節(jié)基因組的編碼和非編碼區(qū)域。

CRISPRi

CRISPRi技術(shù)能抑制指定目標的轉(zhuǎn)錄，不論是編碼還是非編碼的DNA片段。CRISPRi使用催化失活的Cas9（dCas9），dCas9能到達引導(dǎo)RNA指定的位點，但無力對DNA進行剪切（Cell, 152:1173-83, 2013）。當dCas9結(jié)合到基因組的時候，會阻斷轉(zhuǎn)錄機器的結(jié)合，阻止這一過程的進行。

改良版CRISPRi在dCas9上連接了一個來自轉(zhuǎn)錄沉默子（KRAB）的結(jié)構(gòu)域。這個大約50aa的添加阻礙了DNA伸展，使其難以得到轉(zhuǎn)錄。“KRAB結(jié)構(gòu)域的使用目前效果很好，”Corn說。牛津大學的Andrew Bassett也同意這一看法，他認為剛開始接觸CRISPRi的新手應(yīng)該優(yōu)先考慮KRAB。雖然它作用于比較大的位點，但抑制效果也更強，更容易被我們觀察到。

CRISPRi的可逆性是一種特色，不過這也限制了該技術(shù)的應(yīng)用。一些研究者正在利用KRAB結(jié)構(gòu)域讓dCas9結(jié)合得更加穩(wěn)定，以實現(xiàn)永久抑制特定位點的轉(zhuǎn)錄。人們可以通過這種方法研究表觀遺傳學標記的跨代遺傳，Corn指出。

RNAi VS CRISPRi

研究基因功能最常見的方法是，減少或者阻斷基因表達，然后進行表型分析。十多年來，RNAi一直是這一領(lǐng)域的王者，然而新興技術(shù)的涌現(xiàn)（尤其是CRISPR技術(shù)）正在逐漸瓦解RNAi的統(tǒng)治地位。日新月異的技術(shù)發(fā)展為生物學研究提供了越來越大的助力，也給研究者們帶來了一個有些糾結(jié)的問題，“到底應(yīng)該選擇那一種技術(shù)呢”。

RNA干擾（RNAi）靶標成熟的RNA，而CRISPRi阻止轉(zhuǎn)錄的起始。如果你的研究核心是轉(zhuǎn)錄活動而不是RNA產(chǎn)物，那么CRISPRi更有優(yōu)勢。此外CRISPRi還可以靶標細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本，RNAi試劑則很難做到這一點。

RNAi的脫靶效應(yīng)一直令人擔憂。雖然CRISPR系統(tǒng)也存在脫靶效應(yīng)，但要比RNAi少得多，因為CRISPRi必須在轉(zhuǎn)錄起始位點附近才能發(fā)揮作用。目前我們對RNAi的問題更為了解，Corn說，因此他的研究團隊仍在使用RNAi。不過Corn相信RNAi未來難免會江河日下。

未完待續(xù)

Molecular Cell雜志技術(shù)特刊的一篇文章對RNAi、TALEN和CRISPR這三大工具進行了全面比較，為基因功能研究提供了一份實用指南。研究者們可以根據(jù)自己的需要，簡單直觀的找到最適合自己的技術(shù)。現(xiàn)在這篇文章可以免費下載（更多詳細信息參見：CRISPR、RNAi、TALEN一張圖教你做出正確選擇）

RNAi比較容易出現(xiàn)錯誤，siRNA/shRNA的脫靶效應(yīng)會引起假陽性結(jié)果，siRNA/shRNA缺乏活性會引起假陰性結(jié)果。此前，加州大學舊金山分校的研究團隊通過建立超復(fù)雜混合shRNA文庫（ultracomplex pooled short-hairpin RNA libraries），在很大程度上克服了RNAi用于全基因組篩選時的脫靶效應(yīng)。現(xiàn)在他們通過系統(tǒng)改良進一步增強了shRNA的活性，向人們展示了靶標人類和小鼠基因組的新一代shRNA文庫。（更多詳細信息參見：與CRISPR旗鼓相當?shù)男乱淮鶵NAi ）

CRISPR-Cas9在醫(yī)療領(lǐng)域有著廣闊的前景，可以用來矯正致病突變，治療人類疾病。研究者們也在嘗試用這一技術(shù)操縱生態(tài)群體，比如根據(jù)毒力或者抗性基因殺死相應(yīng)的細菌、快速改變種群性狀、控制入侵物種、改良主要農(nóng)作物等等。此外，CRISPR-Cas9還有著很大的潛力，可以被改造為更強大的研究工具。加州大學伯克利分校的Jennifer A. Doudna在Molecular Cell雜志上發(fā)表文章，全面探討了CRISPR-Cas9在各方面的應(yīng)用。Doudna是CRISPR技術(shù)的共同開發(fā)者，曾因這一技術(shù)獲得了“生命科學突破獎”（Breakthrough Prize），也是CRISPR專利的有力競爭者。（更多詳細信息參見：CRISPR只是基因組編輯？你已經(jīng)OUT了）