開發(fā)一種新的轉(zhuǎn)印操作

盡管上一節(jié)提到緩沖液和轉(zhuǎn)印條件的選擇可能非常復(fù)雜，但Towbin等定義的槽轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（1979）和由Kyhse-Anderson定義的半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（1984）能適用于大部分的蛋白質(zhì)樣品。這兩者都代表了出色的起點。不過，假如它們的確并非最適合于某個特定蛋白質(zhì)，那么可調(diào)整轉(zhuǎn)印條件，以配合蛋白質(zhì)的生化特性。Otter等（1987）介紹了一種有趣的優(yōu)化策略，適合分子量在8,000至>400,000 kDa范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)的有效轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)印緩沖液可添加0.01% SDS，以維持高分子量蛋白質(zhì)的溶解度，以及20%甲醇，以增強(qiáng)吸附。電場可以兩個階段施加。轉(zhuǎn)印的最初一小時是以低電流密度，以減慢低分子量蛋白質(zhì)的遷移速率，增加它們在膜上的停留時間。之后以高電流密度，以洗脫高分子量的蛋白質(zhì)。

在開發(fā)一種新的轉(zhuǎn)印操作或處理一種新的樣品類型時，凝膠應(yīng)被染色，以驗證所有蛋白質(zhì)是否從凝膠上徹底洗脫。強(qiáng)烈建議在每塊凝膠上點上一道預(yù)染marker，以監(jiān)控轉(zhuǎn)印效率。一些蛋白質(zhì)在標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)印緩沖液中的溶解度有限，需要修改緩沖液試劑，以防止沉淀。另外一些蛋白質(zhì)，如組蛋白和核糖體蛋白，在標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)印緩沖液中帶正電荷，將向陰極遷移。在凝膠的陰極端放上一張Immobilon®-P膜，可實現(xiàn)這些蛋白質(zhì)的成功轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印后的膜染色也很有用，可確保目標(biāo)蛋白在印跡上。詳見下面的“蛋白質(zhì)觀察”，了解能與后續(xù)的免疫檢測兼容的染料信息。

另一個監(jiān)控蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移的方法是在電轉(zhuǎn)前對SDS-PAGE凝膠染色（Thompson和Larson，1992）。在這種方法中，凝膠在電泳后，或電泳過程中用考馬斯亮藍(lán)染色。免疫檢測過程中的轉(zhuǎn)移蛋白仍保持染色狀態(tài)，從而為蛋白定位和大小確定提供一套背景marker（Thompson和Larson，1992）。

準(zhǔn)備蛋白質(zhì)鑒定的膜

對于染色和免疫檢測

PVDF膜應(yīng)用去離子水清洗，以去除任何凝膠碎片。轉(zhuǎn)印膜隨后可與封閉液一起孵育。

對于通過透照法的快速免疫檢測和觀察

在轉(zhuǎn)印完成后，PVDF膜應(yīng)徹底干燥，才能繼續(xù)染色或進(jìn)行免疫檢測。干燥增強(qiáng)了蛋白質(zhì)與PVDF聚合物的吸附，有助于減少后續(xù)分析過程中的解吸附。隨著轉(zhuǎn)印膜變干，它變得不透明。這種光學(xué)變化是一種表面現(xiàn)象，會掩蓋孔深處水的保留。轉(zhuǎn)印膜應(yīng)按照建議的時間干燥，以確保所有液體從膜的孔結(jié)構(gòu)內(nèi)蒸發(fā)。

保存

在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上之后，PVDF膜可以干燥保存很長一段時間，對膜或蛋白質(zhì)無不良影響（4 °C最多兩周；–20 °C最多兩個月；–70 °C可保存更長時間）。然而，一旦在不可控的環(huán)境下長期保存，一些蛋白質(zhì)可能對化學(xué)變化（如氧化、脫酰胺化、水解）敏感。建議在低溫下長期保存。在進(jìn)一步分析之前，干燥的膜必須在100%甲醇中浸濕。

（實際內(nèi)容以《蛋白質(zhì)印跡手冊》印刷版為準(zhǔn)，如有錯漏，敬請諒解）

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