透照

透照（圖10）是一種PVDF膜特有的觀察技術，首次介紹就是應用于Immobilon®-P轉印膜上（Reig和Klein，1988）。這種技術利用PVDF膜特有的性質；被轉印蛋白包被的PVDF區域能夠在20%甲醇中浸濕，而PVDF的周圍區域不行。PVDF濕潤的區域逐漸變得光學透明，能夠利用背光和照相存檔來觀察蛋白條帶。此過程通過蒸發而完全可逆。因為蛋白質在轉印過程中已暴露在甲醇中，所以蛋白質的進一步變性基本不會發生。盡管這種技術不能用于觀察低豐度蛋白，但它能用來評估整體的轉移效率以及印跡是否適合進一步分析。

染色

染色（圖10）是一種讓印跡上的蛋白質可見的簡單技術。染色可用于：

• 驗證蛋白質是否轉移到膜上。
• 確定各泳道是否相同上樣。
• 評估整體的轉移效率，特別是對于新的緩沖液或蛋白質。
• 鑒定和切割條帶用于肽段測序。

目前有許多類型的染料，包括有機染料（麗春紅、氨基黑、固綠和考馬斯亮藍）、熒光染料（熒光胺、香豆素）以及膠體粒子（金、銀、銅、鐵和印度墨汁）（Kurien等，2003）。表5列出了在Western印跡中檢測總蛋白的最常用染料。這些染料可分為兩類：可逆和不可逆的染料。

可逆染料

可逆染料允許在評估印跡之后將其從膜上洗掉。這些操作不干擾后續的免疫檢測或印跡上蛋白質的其他分析。最常用的蛋白可逆染料是麗春紅。

可逆染料的主要缺點在于它們的靈敏度不及不可逆染料。由于印跡上高豐度蛋白的染色模式通常也能很好地指示了低豐度蛋白在多大程度上轉移，這一缺點在大部分情況下被最小化。

熒光染料高度靈敏，且與下游的免疫檢測、基于Edman的測序和質譜分析兼容（Berggren等，1999）。Sypro® Ruby和Sypro® Rose蛋白印跡染料（Life Technologies）可在顯色、熒光或化學發光免疫染色步驟前使用，并可實現約1-2 ng/條帶的檢測靈敏度（Haugland，2002）。

不可逆染料

不可逆染料通常表現出最佳的靈敏度，但會干擾或阻止蛋白質的進一步分析。不可逆染料有氨基黑和考馬斯亮藍。

圖10. 小牛肝臟蛋白在電轉到Immobilon®-P轉印膜后的觀察：(A) 透照，(B) 考馬斯亮藍，(C) 麗春紅，(D) 氨基黑和(E) CPTS總蛋白染料。從左到右，每條泳道依次是分子量標準品和12.2 μg、6.1 μg、3.1 μg裂解液。

表5. Western印跡中常用的染料及其性質。

（實際內容以《蛋白質印跡手冊》印刷版為準，如有錯漏，敬請諒解）

立即索取印刷版《蛋白質印跡手冊》

上一篇          下一篇