轉印緩沖液

轉印緩沖液提供了電極之間的電連續(xù)性，必須是導電的。它還提供了一個化學環(huán)境，能維持蛋白質(zhì)的溶解度，又不妨礙轉移過程中蛋白質(zhì)吸附到膜上。對于大多數(shù)蛋白質(zhì)樣品，常見配方可實現(xiàn)這些功能。大部分緩沖液在轉移過程中發(fā)生焦耳加熱。基于這個原因，許多槽轉印系統(tǒng)都配有內(nèi)置的冷卻管。轉印槽還可以放在冷室內(nèi)，而緩沖液可以在使用前經(jīng)過預冷。在半干轉印系統(tǒng)中，電極板還可作為散熱片。但它們的散熱能力有限，因此半干系統(tǒng)一般不用于長時間轉印。

傳統(tǒng)的轉印緩沖液包含緩沖系統(tǒng)和甲醇。Towbin緩沖液（1979），Tris甘氨酸緩沖液，常用于槽轉印系統(tǒng)中。這種緩沖液的pH值為8.3，比大多數(shù)蛋白的等電點（pI）要高。在凝膠上分離的蛋白質(zhì)帶負電荷，向陽極遷移。由于槽內(nèi)的緩沖液是混合的，故轉移過程中的離子分布保持相對恒定。

半干系統(tǒng)可利用單一或三重緩沖液系統(tǒng)（Kyhse-Anderson定義，1984）來運行。使用三重緩沖液，是因為轉移是個等速電泳的過程，其中蛋白質(zhì)在領先離子和尾隨離子之間移動（Schafer-Nielsen等，1980）。在某些情況下，三重緩沖液系統(tǒng)可實現(xiàn)更好的定量轉移。這三重緩沖液分別為：

• 陽極緩沖液I：0.3 M Tris，pH 10.4
• 陽極緩沖液II：25 mM Tris，pH 10.4
• 陰極緩沖液：25 mM Tris和40 mM ε-氨基己酸，pH 9.4

陽極緩沖液I中和陽極板表面產(chǎn)生的過量質(zhì)子。陽極緩沖液II與陽極緩沖液I的pH值相同，但Tris濃度低至25 mM。陰極緩沖液包含ε-氨基己酸，作為轉移過程中的尾隨離子，并在陰極緩沖液中逐漸耗盡，因為它穿過凝膠向陽極移動。對于半干系統(tǒng)中采用單緩沖液，請查詢制造商的建議。

盡管上面定義的緩沖液系統(tǒng)適用于大多數(shù)蛋白轉印，但文獻中包含許多變化，適用于不同的應用。最明顯的變化之一是在蛋白測序應用中，建議使用10 mM CAPS緩沖液（pH 11）（Matsudaira，1987）。Towbin緩沖液中使用以及凝膠電泳緩沖液中殘留的甘氨酸導致采用Edman原理的自動蛋白測序儀中出現(xiàn)高背景。通過改變轉印緩沖液的配方，這種假象明顯減少。緩沖液強度及組成的任何修改應小心進行，以確保轉印裝置不會過熱。

轉印緩沖液甲醇的功能

添加到轉印緩沖液中的甲醇有兩個主要功能：

• 穩(wěn)定凝膠的尺寸。
• 從蛋白質(zhì)分子上解離出復合的SDS。

聚丙烯酰胺是一種水凝膠，具有吸收水分的能力。在純水中，各個維度的凝膠尺寸都有相當量的增加。溶脹度也取決于凝膠中所使用的丙烯酰胺的濃度。高濃度的凝膠比低濃度的凝膠溶脹得更多。梯度膠會明顯突出這種影響，其底部高濃度的區(qū)域比頂部溶脹得更多。開始時是矩形的凝膠可能會變成梯形。添加到轉印緩沖液中的甲醇能最大限度地減少凝膠溶脹，而轉印操作通常也包括一個平衡步驟，以達到凝膠尺寸的穩(wěn)定性。當甲醇濃度為10%-20%時，尺寸穩(wěn)定性可相當快速地實現(xiàn)。當甲醇濃度較低時，平衡需要更長的時間才能實現(xiàn)。如果在轉移過程中發(fā)生尺寸改變，蛋白質(zhì)的分辨可能會損失。對于在甲醇中溶解度有限的高分子量蛋白質(zhì)，甲醇的減低會導致蛋白轉移效率明顯提高，但這可能需要更長的平衡時間來確保尺寸穩(wěn)定性。

甲醇的第二個功能對于蛋白質(zhì)從包含SDS的凝膠上轉移很關鍵。甲醇可幫助從蛋白質(zhì)分子上解離所復合的SDS（Mozdzanowski和Speicher，1992）。盡管SDS對凝膠上單個蛋白質(zhì)的分辨很必要，但是對于有效印跡卻是極為不利的。首先，SDS的結合給蛋白質(zhì)分子帶來高的負電荷密度，導致蛋白質(zhì)分子非�？焖俚卮┻^膜，減少在孔結構內(nèi)的停留，從而降低分子間相互作用的機會。其次，通過包被蛋白質(zhì)分子，SDS限制蛋白質(zhì)與PVDF進行分子接觸的能力。這些影響隨著蛋白質(zhì)的分子量降低而增加。甲醇通過解離SDS，并提高蛋白質(zhì)分子與膜結合的可能性，從而減少這兩方面的影響。

（實際內(nèi)容以《蛋白質(zhì)印跡手冊》印刷版為準，如有錯漏，敬請諒解）

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