生物通報道：單克隆抗體一直是基礎研究、醫學診斷和疾病治療中的重要工具。制備單克隆抗體的傳統方法，是諾貝爾獎獲得者Georges Köhler和César Milstein在上世紀七十年代開發出來的。這一方法包括：讓小鼠接觸特定抗原，收集它體內的抗體生產細胞，然后將這些細胞與骨髓瘤細胞融合，形成能夠長時間體外培養的雜交瘤。這種技術可以幫助人們生產大量高度特異性的抗體。

然而，動物源的抗體不能用于人體治療，因為它們會觸發人體的免疫反應。為了在人體免疫細胞應答特定病原體時，獲取細胞產生的抗體，科學家們又開發了一些新的方法。例如，從血樣中分離記憶性B細胞，然后利用Epstein-Barr感染使這些細胞具有永生能力，再在其中篩選能夠生成特異性抗體的細胞。“這個方法非常費勁，因為你要制備這些細胞系，對大量的細胞進行篩選，”芝加哥大學的免疫學副教授Patrick Wilson說。另外，不是所有的細胞都能在永生化過程中存活下來，這無疑限制了天然抗體的產量。

最近Wilson等人找到了一個新辦法，他們從活躍應答病原體或疫苗的人類血液中，分離具有抗原特異性的單個B細胞，然后對細胞中編碼抗體重鏈和輕鏈的兩個基因進行克隆。這些基因的序列在不同細胞中是有差異的，“不能把細胞混在一起，因為那樣你可能得到一個細胞的重鏈和另一個細胞的輕鏈”，這樣就不能獲得天然的重輕鏈組合。克隆了兩個基因之后，就可以在此基礎上生產重組抗體，這一技術也被稱為表達克隆（expression cloning）。“這個技術沒什么限制，只要分離到B細胞就可以制造相應的抗體，”Wilson說。“問題在于實驗的步驟比較繁瑣。”

表達克隆法最適合“在獲得了大量抗原特異性細胞時使用，而這些細胞只有在疫苗接種或感染之后才會出現，”Wilson說。如果沒有產生活躍的免疫應答，這個技術鑒定抗體就會非常吃力。因為血液中存在著數百萬記憶性B細胞，它們都針對著不同的抗原。

上述技術都是鑒定新抗體和研究人類免疫應答的寶貴工具，不過這些技術都很耗時也比較復雜。為了加快抗體研發的速度，The Scientist雜志聯系了相關領域的一些專家，請他們分享了自己使用新興技術進行抗體鑒定和分離的經驗。

基于細胞培養的方法

使用者：NIH國家過敏與傳染病研究所的Mark Connors

項目：分離廣譜而且強效的新HIV中和抗體

遇到的問題：HIV患者的抗體生產細胞永生化效率較低，就算成功永生化，一些克隆也并不穩定。此前有研究者通過熒光探針從血樣中提取抗原特異性的記憶性B細胞，并由此獲得HIV中和抗體。Connors及其團隊希望在不依賴已知抗原的條件下，尋找新的HIV中和抗體。（延伸閱讀：PNAS：常用HIV藥物難以深入淋巴組織）

解決辦法：Connors及其團隊首先使用流式細胞儀從HIV感染者的血液中分離B細胞。他們并沒有采用常規的表達克隆（克隆各個細胞的重鏈和輕鏈基因），而是將分離到的細胞分裝在384孔板中。他們用滋養層細胞和信號分子保持B細胞的活性，同時刺激它們分泌抗體。在大約兩周后，研究人員檢驗了每個孔上清液在體外中和HIV的能力。隨后，他們選取了有中和能力的細胞，并對其中的抗體基因進行克隆，最后制成重組抗體。Connors和他的團隊用這一方法，分離了兩個能夠強力中和多種HIV病毒株的新抗體。

優點：

•使用者不需要事先知道抗體的結合特異性

•可以用于多種疾病。“只要你有能夠進行篩選的目標功能，就可以提取抗體，” Connors說。

•完成整個過程只需要三周，Connors說。

•滋養層細胞可以通過AIDS reagent program免費得到

缺點：

•中和分析所需的試劑比較貴

•理論上這一方案可以手動完成，但需要篩選的孔很多（Connors篩選了60,000–140,000個孔），因此這一技術更適合擁有自動化液體處理設備的實驗室。

•一些抗體生產細胞可能在培養過程中無法存活。

成本：據Connors估計，每個384孔板大約需要$400–$500。手動操作一般需要約20塊板，自動化實驗操作一般需要60–80塊板，具體還是要看血樣中有多少B細胞。

高通量DNA測序

使用者：德克薩斯大學的George Georgiou教授

項目：用高通量測序鑒定天然的人類抗原特異性抗體

遇到的問題：2010年Georgiou的研究團隊向人們展示，可以通過免疫球蛋白基因的高通量測序，快速生產抗原特異性的抗體。隨后，研究團隊對小鼠進行免疫接種，然后選取了抗體生產細胞中表達量最為豐富的重鏈和輕鏈基因，將它們重組成為抗體。但這一方法無法辨別抗體生產細胞中的原始重/輕鏈配對。Georgiou發現，要想構建天然抗體，就要找到同時測序重鏈和輕鏈的方法。

解決辦法：Georgiou的研究團隊先用流式細胞儀從血液中純化B細胞，將細胞一個個分配到125皮升的微孔中。隨后他們裂解細胞，并用磁性微珠捕獲重鏈和輕鏈的可變區mRNA（VH 和VL）。對這些mRNA進行PCR擴增，可以將VH和VL轉錄本結合在一起形成一個cDNA擴增子。在此基礎上，研究人員可以通過測序和生物信息學分析來確定VH: VL的配對情況。

研究人員利用這一技術，在應答破傷風類毒素的抗體生產細胞中鑒定了86個重/輕鏈對。他們選擇其中的10對制備了10種重組抗體，結果這些抗體都能夠在體外與破傷風類毒素高親和力結合。而之前的研究顯示，通過重鏈和輕鏈隨機配對生產的抗體，只有大約10%具備抗原特異性。

優點：

•非常快。“從分離細胞到獲得全天然的人類重/輕鏈序列，只需要一周時間，”DeKosky說。

•可以鑒定抗體的天然序列

•不會漏掉罕見B細胞所編碼的免疫球蛋白

•可以在免疫應答的過程中跟蹤B細胞的發育

缺點：

•需要自制微孔芯片

•進行序列分析需要具備一定的生物信息學知識

成本：據DeKosky介紹，獲得2,700對抗體基因序列，需要大約$550的試劑。

蛋白質組學技術

使用者：CST公司的首席科學家Roberto Polakiewicz

項目：鑒定實際存在于人類和動物血液中的抗體，并在此基礎上生產具有高親和力的重組抗體

遇到的問題：以細胞為基礎的抗體制備策略（不論是B細胞永生化、表達克隆還是測序）都不能代表血液中真實存在的所有抗體。這是因為，有些細胞會在分離過程中死亡，而有些細胞編碼的抗體可能并不釋放到血液中去。“我們制備抗體的目的是對抗感染，” Polakiewicz說，所以“真正重要的是血液循環中的抗體，這些抗體才負責發現病原體并召集免疫細胞展開攻擊。”為此，Polakiewicz及其同事希望開發一個策略，直接分析血液循環中的抗體。

解決方法：Polakiewicz的研究團隊采用了蛋白質組學技術。他們先通過親和純化，從接種過乙肝疫苗的血液中分離和富集特異性的抗體。隨后，研究團隊用蛋白酶將這些抗體消化成多肽片段，并對它們進行質譜分析。為了解讀這些質譜數據，研究人員測序了供體B細胞的抗體基因，并在此基礎上建立了參考數據庫。“不能使用整個基因組，” Polakiewicz說。“那樣會給你生殖細胞系的B細胞序列，而我們需要的是免疫接種后從頭生成的序列。”

通過比較免疫球蛋白的基因序列與多肽的質譜數據，研究人員鑒定和克隆了血液中的抗體重/輕鏈基因，并由此生產了多種重組抗體，這些抗體都能與乙肝病毒抗原高親和力的結合。

優點：

•能夠分析人體血液循環中出現的抗體成分

•可以用來跟蹤血液抗體譜發生的變化

缺點：

•需要自制進行多肽和基因序列分析的生物信息學軟件

•破壞了血液中抗體重/輕鏈的天然配對。

•需要使用者具備測序和質譜的專業知識

•比較費力，生成功能性的重組單克隆抗體需要21天

成本：Polakiewicz未能估算出這一方案的具體成本，但他指出這一方案的花銷跟常用的方法差不多，甚至還可能更低一些。

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Accelerating Antibody Discovery