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蛋白質印跡手冊1：膜的選擇
【字體： 大 中 小 】 時間：2014年05月19日 來源：默克密理博
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PVDF膜和NC膜作為Western印跡應用中最常用的兩種類型的膜，各有什么特點？我們該如何選擇？近四十年來，默克密理博一直是轉印膜的領先供應商。它目前提供三種PVDF膜。這三種膜有何不同，分別適合哪些應用呢？詳見本文。
Part 1 膜的選擇
印跡所使用的膜的類型可能影響下列因素：
• 蛋白質結合能力
• 是否需要用醇預濕
• 開展多次剝離（stripping）和再生檢測（reprobing）實驗的能力
• 蛋白質觀察
• 長期印跡保存
• 信噪比
聚偏二氟乙烯（PVDF）和硝酸纖維素是Western印跡應用中最常用的兩種類型的膜。
與硝酸纖維素膜相比，電轉到PVDF膜上有許多優(yōu)點。PVDF膜可提供更好的蛋白質截留率、物理強度和廣泛的化學兼容性（Pluskal等，1986）。其中更高的機械強度和出色的耐化學性讓PVDF膜成為免疫檢測中各種染色應用和二次檢測的理想選擇。使用PVDF膜的另一個優(yōu)點是，單塊凝膠上的平行重復泳道可用于各種應用中，如考馬斯藍染色，接著切割條帶進行N端測序，蛋白質水解/肽段分離/內部測序，以及免疫檢測（Kurien等，2003）。市售的硝酸纖維素膜的典型結合能力是80 – 100 μg/cm2，而PVDF膜的結合能力是100 – 200 μg/cm2。
在檢測血清中人免疫缺陷病毒（HIV）時直接比較PVDF和硝酸纖維素膜，結果表明，PVDF膜有著更好的總體HIV抗原截留率，并且有助于改善提高抗體對糖基化包膜抗原的檢測（Lauritzen和 Pluskal，1998）。硝酸纖維素膜和PVDF膜的特性比較詳見表1。
表1. PVDF和硝酸纖維素膜特性及應用的比較。
|
特性/應用 |
硝酸纖維素 |
PVDF |
|
物理強度 |
差 |
好 |
|
蛋白質結合能力 |
80 – 100 μg/cm2 |
100 – 300 μg/cm2 |
|
耐溶劑性 |
否 |
是 |
|
Western轉移 |
是 |
是 |
|
總蛋白染料 |
膠體金 |
膠體金 |
|
麗春紅 |
麗春紅 | |
|
氨基黑 |
氨基黑 | |
|
印度墨汁 |
印度墨汁 | |
|
Sypro® 印跡染料 |
考馬斯藍染料 | |
|
顯色 | ||
|
化學發(fā)光 |
化學發(fā)光 | |
|
熒光 |
熒光 | |
|
放射性 |
化學熒光 | |
|
|
放射性 | |
|
雙印跡方法 |
否 |
是 |
|
快速免疫檢測 |
否 |
是 |
|
Western再次雜交 |
是 |
是 |
|
Edman測序 |
否 |
是 |
|
氨基酸分析 |
是 |
是 |
|
SDS存在下的結合 |
差 |
好 |
|
膜上消化或質譜分析 |
否 |
是 |
|
直接MALDI-TOF MS分析 |
否 |
是 |
|
數(shù)據(jù)可存檔 |
否 |
是 |
Immobilon® PVDF轉印膜
默克密理博提供三種PVDF膜：
• Immobilon®-P膜（0.45 μm）是一種通用的基質，適用于一般的免疫印跡應用。
• Immobilon®-PSQ膜（0.2 μm）適用于蛋白質測序和低分子量蛋白的免疫印跡。它有著更高的蛋白質結合能力以及比0.45 μm膜更高的截留率。
• Immobilon®-FL膜（0.45 μm）是為熒光免疫檢測而開發(fā)的。它在多種激發(fā)和發(fā)射波長范圍內的熒光背景都極低。
Immobilon® 轉印膜以卷膜和方片膜形式提供。預切好的膜與所有預制膠以及大部分市售的凝膠電泳系統(tǒng)兼容。Immobilon® 轉印膜的性質詳見表2。表3列出了與最常用的電泳系統(tǒng)相匹配的Immobilon® 預切膜的尺寸。表4列出了與現(xiàn)有的預制膠相匹配的Immobilon® 預切膜的尺寸。
表2. Immobilon® PVDF轉印膜的性質和應用。
|
|
Immobilon®-P轉印膜 |
Immobilon®-PSQ轉印膜 |
Immobilon®-FL轉印膜 |
|
描述 |
為結合從各種凝膠基質上轉移的蛋白質而優(yōu)化 |
均一的孔徑結構帶來分子量<20 kDa的蛋白質的出色結合 |
為熒光免疫檢測應用而優(yōu)化 |
|
組成 |
PVDF |
PVDF |
PVDF |
|
孔徑大小 |
0.45 μm |
0.2 μm |
0.45 μm |
|
疏水性 |
疏水 |
疏水 |
疏水 |
|
應用 |
Western印跡 |
低分子量 |
Western印跡 |
|
結合分析 |
Western印跡 |
斑點/狹縫印跡 | |
|
氨基酸分析 |
氨基酸分析 |
熒光免疫檢測 | |
|
N端蛋白測序 |
質譜分析 |
| |
|
斑點/狹縫印跡 |
N端蛋白測序 |
| |
|
糖蛋白觀察 |
|
| |
|
脂多糖分析 |
|
| |
|
質譜分析 |
|
| |
|
檢測方法 |
顯色 |
顯色 |
熒光 |
|
化學熒光 |
熒光 |
顯色 | |
|
化學發(fā)光 |
化學熒光 |
化學熒光 | |
|
放射性 |
化學發(fā)光 |
化學發(fā)光 | |
|
|
放射性 |
| |
|
蛋白質結合能力 |
胰島素：160 μg/cm2 |
胰島素：262 μg/cm2 |
胰島素：155 μg/cm2 |
|
BSA：215 μg/cm2 |
BSA：340 μg/cm2 |
BSA：205 μg/cm2 | |
|
山羊IgG：294 μg/cm2 |
山羊IgG：448 μg/cm2 |
山羊IgG：300 μg/cm2 | |
|
兼容的可逆染料 |
透射法 |
透射法 |
透射法 |
|
麗春紅 |
麗春紅 |
麗春紅 | |
|
CPTS |
CPTS |
CPTS | |
|
甲苯胺藍 |
甲苯胺藍 |
Sypro 印跡染料 | |
|
Sypro® 印跡染料 |
Sypro 印跡染料 |
| |
|
兼容的不可逆染料 |
考馬斯亮藍染料 |
考馬斯亮藍染料 |
考馬斯亮藍染料 |
|
氨基黑 |
氨基黑 |
氨基黑 | |
|
印度墨汁 |
印度墨汁 |
| |
|
膠體金 |
膠體金 |
|
表3. Immobilon® PVDF預切轉印膜和匹配的電泳系統(tǒng)。
表4. Immobilon® PVDF預切轉印膜和匹配的預制膠。
（實際內容以《蛋白質印跡手冊》印刷版為準，如有錯漏，敬請諒解）
