生物通報道：重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)（由英國公司TwistDx Inc開發(fā)）。以此為基礎(chǔ)的TwistAmp® 核酸擴(kuò)增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測。該技術(shù)對硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

RPA在臨床診斷領(lǐng)域的應(yīng)用

艱難梭狀芽孢桿菌（C. difficile）是一種會引起感染性腹瀉的重要致病菌。日前，研究人員以這種致病菌的毒力基因tcdB為靶標(biāo)，開發(fā)了一個低成本的微流體RPA平臺，文章發(fā)表在十月二十三日的《Analyst》雜志上。這個檢測C. difficile的RPA分析芯片只需要6.4 µL的初始樣本，能夠?qū)�擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行實時監(jiān)控。（參考文獻(xiàn)：Real-time microfluidic recombinase polymerase amplification for the toxin B gene of Clostridium difficile on a SlipChip platform）

據(jù)估計，世界上約三分之一的人體內(nèi)潛伏著結(jié)核病（TB）的致病菌，這些致病菌大多在肺部處于休眠狀態(tài)。改善檢測方法幫助TB診斷，被WHO列為公共建康的首要問題之一。RPA作為一種常溫的快速DNA 擴(kuò)增法，為資源匱乏的地區(qū)提供了檢測TB的簡便工具。研究人員在RPA的基礎(chǔ)上，快速檢測了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群MTC的DNA（IS6110 和IS1081）。在39°C的環(huán)境下，RPA檢測能在20分鐘內(nèi)得出高靈敏度的結(jié)果。進(jìn)一步研究表明，在檢測TB感染者的肺部樣本時，RPA檢測比熒光顯微鏡檢測還要準(zhǔn)確。這項研究發(fā)表在今年八月份的《Plos one》雜志上。（參考文獻(xiàn)：Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis by Recombinase Polymerase Amplification）

抗生素濫用現(xiàn)象使耐藥菌日漸增多，目前這已經(jīng)成為了一個全球性的公共健康問題。作為一種重要且危險的致病菌，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA一直是臨床治療中的棘手問題。在對MRSA進(jìn)行DNA檢測的時候，引物只能靶標(biāo)一個多變的染色體區(qū)域，SCCmec。今年七月的《Plos one》雜志上發(fā)表的一項研究，通過多重RPA反應(yīng)篩查了726個MRSA分離物。研究人員通過二代測序發(fā)現(xiàn)，24個RPA未檢出的分離物中出現(xiàn)了新的插入突變，需要重新設(shè)計擴(kuò)增引物。這一結(jié)果說明，臨床上的MRSA篩查不能完全依賴DNA檢測。（參考文獻(xiàn)：Recombinations in staphylococcal cassette chromosome mec elements compromise the molecular detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus.）

《Microchimica Acta》雜志今年二月的一項研究，展示了能夠同時擴(kuò)增和檢測三種病原體的RPA芯片，包括淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）、沙門氏菌（Salmonella enterica）和MRSA。這種芯片可以在二十分鐘以內(nèi)完成三種病原體和對照質(zhì)粒的檢測，S. enterica和MRSA的檢出限可達(dá)10 CFU，N. gonorrhoeae的檢出限可達(dá)100 CFU。這項研究中的RPA芯片，有望成為實地篩查重要致病菌的簡便工具。（參考文獻(xiàn)Multiplex isothermal solid-phase recombinase polymerase amplification for the specific and fast DNA-based detection of three bacterial pathogens）（延伸閱讀：替代PCR，RPA在HIV檢測中大展身手）

RPA在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用

產(chǎn)志賀毒素的大腸埃希菌STEC是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的一種食源性致病菌。《FOODBORNE PATHOGENS AND DISEASE》雜志今年七月發(fā)表的一項研究，在RPA的基礎(chǔ)上首次建立了等溫實時的STEC檢測體系。研究人員設(shè)計并評估了一系列引物和熒光探針，實現(xiàn)了很高的特異性和靈敏度。（參考文獻(xiàn)：Real-time isothermal detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli using recombinase polymerase amplification.）

沙門氏菌是一種主要的食源性致病菌。《Analytical Chemistry》雜志今年三月份發(fā)表的一項研究，將TwistFlow®沙門氏檢測整合到微流體裝置中，構(gòu)建了檢測沙門氏菌DNA的一體化分析系統(tǒng)。這一微流體裝置整合了致病菌檢測的三個主要步驟（DNA提取、RPA擴(kuò)增和結(jié)果檢測），能夠在三十分鐘內(nèi)以全自動的方式完成檢測。人們可以直接通過側(cè)流層析試紙條看到沙門氏菌檢測的結(jié)果。研究顯示，這種裝置。對PBS和牛奶的檢測下限分別為10 CFU/ml和100 CFU/ml。（參考文獻(xiàn)：Fully Integrated Lab-on-a-Disc for Nucleic Acid Analysis of Food-Borne Pathogens）

PCR- ELISA已經(jīng)是一個用途相當(dāng)廣泛的成熟技術(shù)。《Analytica Chimica Acta》雜志今年二月發(fā)表的一項研究，首次用RPA取代了PCR，將快速的常溫擴(kuò)增、生物素/鏈霉親和素體系、和比色法免疫分析結(jié)合起來。這種RPA-ELISA分析法可以用來篩查食品中的安全隱患，比如過敏原（榛子、花生、大豆、蕃茄和玉米）、轉(zhuǎn)基因成分（P35S和TNOS）、致病菌（Salmonella sp.和Cronobacter sp.）以及真菌（Fusarium sp.）。這項研究顯示，RPA-ELISA在上述應(yīng)用中均得到了令人滿意的結(jié)果，有著很高的靈敏度和可重復(fù)性。（參考文獻(xiàn)：Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis.）

生物通編輯：葉予