導言
       導言：號稱第三代的單分子測序技術，又是一個劃時代的新里程碑，必將為研究開辟出新的領域和思路，不可錯過。可惜PacBio廠家公開的技術講座今年四月在國內只得2場，講座實況暫不允許公開，故生物通編者整理了一份詳盡的講座筆記并稍作調整補充，以饗讀者。

技術原理

關鍵點之一：DNA聚合酶        DNA聚合酶和模板結合，4色熒光標記4種堿基，經過Watson配對后不同的堿基加入，會發出不同光，根據光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。這個DNA聚合酶是實現超長讀長的關鍵之一，讀長主要跟酶的活性保持有關，主要受激光對它的損傷的影響。PacBio還在不斷優化聚合酶的性能，比如給聚合酶加上免受激光影響的保護基團等，進一步地提高讀長，提高測序質量和通量。詳細

單個ZMW底部固定有一個結合了模板DNA的聚合酶，當加入測序反應試劑后，每個堿基配對合成后會發出相應的光并被檢測。一個SMRTCell中有15萬個ZMW，每個孔中有一個單分子DNA鏈在高速合成，如眾星閃爍。原始檢測數據的結果，每合成一個堿基即顯示為一個脈沖峰，每分鐘>100個堿基的速度，配上高分辨率的光學檢測系統，就能實時檢進行檢測。

關鍵點之二：熒光標記位點        二代測序都標記在5‘端甲基上，在合成過程中，熒光標記物保留在DNA鏈上，隨DNA鏈的延伸會產生三維空間阻力導致DNA鏈延長到一定程度后會出現錯讀。這是NGS的測序讀長僅能達到100多bp到200bp的一個原因。        PacBio平臺的堿基熒光標記在3‘端磷酸鍵。在DNA合成過程中正確的堿基進入時，在3’端磷酸鍵的標記是會隨磷酸鍵斷裂自動被打斷，標記物被棄去，亦即合成的DNA鏈不帶熒光標記，和天然的DNA鏈合成產物一致，可以達到很長的讀長。詳細

關鍵點之三：時空段概念        合成過程中，每次進入一個堿基，原始數據會實時地產生一個脈沖峰，每兩個相鄰的脈沖峰之間有一定的距離，也就是有一個時間段的概念。這個距離的長短與模板上堿基是否存在修飾有關，如果有堿基修飾，就像開車經過路障時，通過速度會減慢，導致兩個相鄰峰之間距離加大。根據這個距離的變化，可以判斷模板相應位點是否出現堿基修飾，并且結果是實時的。甲基化就是一種主要的堿基修飾，PacBio技術不僅可以提供序列信息，還可提供實時信息了解模板修飾的情況，用于甲基化等堿基修飾研究。詳細

測序流程和策略

1. 文庫制備 材料：全基因組DNA，或者cDNA，或者目標擴增產物 片段化：全基因組太大需要片段化，因為測序讀長很長，可以做很大的片段文庫（3-10kb） 連接：先把片段粘末端變成平端，兩端分別連接環狀單鏈：單鏈兩端分別與雙鏈正負鏈連接上，得到一個類似啞鈴（“套馬環”）的結構，稱為SMRT Bell。連接半小時內完成。 2. 引物退火 + 聚合酶結合 當引物與模板的單鏈環部位退火后，這個雙鏈部位就可以結合到已固定在ZWM底部的聚合酶上。 3. 測序策略        萬事俱備，一旦向反應中加入正常的離子，DNA聚合反應開始了。模板雙鏈打開成環形，先合成正鏈，單鏈區，跟著合成負鏈。聚合酶每合成一圈，對于定向目標序列，就相當于2x覆蓋度。由于合成產物和天然產物一致，聚合酶可以持續合成很長很長的產物，亦即循環合成很多圈（重復多次），對于定向單分子目標序列來說就可以得到很高的覆蓋度，即獲得很多subread，這就意味著可以對非常低的頻率的片段獲得很高的準確度，這稱為環形一致序列（circle consensus）模式，該模式適用于稀有突變及需要高精確度的測序。這也是單分子測序能比NGS靈敏度更高地，高準確度地檢測到稀有突變的原理。詳細

技術應用
PacBio單分子測序的技術特征如下：

• 超長的讀長——de novo測序中完整基因組的組裝；Target測序中多個突變位點的單倍體型檢測，復雜的多個重復片段的準確測定，長轉錄本及可變剪切體測定等等
• 超高測序準確度及單分子分辨率——特定序列的SNP檢測，稀有突變及其頻率測定
• 動態信息——可獲得甲基化等多種堿基修飾信息

超長的讀長        二代測序的短處在于讀長太短。就像拼圖游戲，越碎的碎片就越難拼接。雖然提供海量的數據，但是依然不足以完成全基因組拼接。去年在Nature上發表的一篇綜述文章指出，二代測序讀長太短是其技術的內有問題（fundamental data properties），數學模式所不能解決的。算法已經很成熟，算法再好，也不足以解決這個問題。        PacBio的超長讀長，可實現以相對較低的覆蓋度達到很好的序列組裝。有助于產生較少的重疊群，幫助全基因組組裝。還可以獲得復雜的DNA重組信息，比如由于斷裂造成的融合基因的Breakpoint，cDNA里包含的剪切，內外顯子間的關系，都需要很長的讀長幫助組裝跨越的區域。        因此，對于全基因組de novo測序來說，更適宜用組合的方法，將第三代和第二代測序方式結合。冷泉港去年宣布研發一個軟件，能將PacBio結果和二代測序結果結合。三代測序的超長讀長，加上二代測序的海量數據（價格低廉），應該是比較好的組合。詳細 定向測序中的SNP檢測        高精確，可做稀有SNP的檢測�？梢詸z測多個SNP的單倍體型，即兩個臨近的SNP在同一鏈上還是在不同鏈上。由于GC含量不影響單分子測序，片段讀長長，可將靶片段準確定位到參考序列上，加上單分子測序的錯誤隨機，沒有PCR引入的偏向性系統誤差，很容易通過提高覆蓋度得到高準確的的數據。Broad研究院經過實驗對比得出的結論，PacBio做SNP檢測假陽性率低，在后續的SNP驗證上是最好的技術手段，該論文即將在Nature Methods上發表。 觀看視頻：Pacbio RS在發現或確認SNP中的優勢

動態信息        PacBio在與對德國大腸桿菌爆發事件中的爆發株進行de novo測序組裝之后，又邀請New England Biolabs公司協助對該大腸桿菌株測序結果進行甲基化方面的生物信息學分析。結果表明該基因組上確實有很多甲基化出現（約45000個）。通過排除法，發現爆發株里有CTGCAG motif特有的甲基化，還發現插入的外源序列中還有一段序列類似甲基化酶，可專門對CTGCAG的序列進行甲基化。對CTGCAG甲基化有關的基因表達分析，發現表達上調的基因包括菌毛，鞭毛體和與細胞注入有關的基因，這些結果也許可能解釋為嗜菌體侵染而注入一段外源基因，其中包含一種甲基化酶，導致爆發株表達改變，提高對宿主吸附性，連同志賀毒素，而導致毒性升高。        由此可見，正由于Pacbio的第三代測序系統得到堿基序列信息的同時獲得了堿基修飾的信息，我們可同時對堿基序列和堿基修飾兩方面測序信息進行分析，可以完整解釋爆發株的強毒性的基因組機制，為表觀遺傳學及疾病基因組學開辟了新的研究思路。詳細 白血病中的突變檢測實例        FLT3過去一直被認為是急性髓細胞白血病（AML）的有效治療靶標，可患者接受靶向FLT3新藥治療后若復發會產生耐藥性，導致科學界對FLT3是否是真正有效靶標產生質疑。FLT3呈受體結構，有一段激酶區域，還有一段稱為ITD的重復序列，ITD上有很多突變，是過去藥物篩選的靶標。最新這項研究試圖發現ITD突變外部的二級突變與抗藥性的關系。        研究發現ITD外部下游區也有很多二級突變產生，和抗藥性有關。二級突變產生的頻率很低，很難找到，所以不受重視，在很多研究中，也沒有將其與抗藥性關聯起來。這些二級突變的長度超過1kb，故二代測序是測不到的。PacBio技術正好可以很容易解決這個問題。結果表明，在沒用藥前，ITD下游二級突變出現頻率不高，但用藥后二級突變出現頻率升高。8個例子中，不同的病人出現突變的頻率和模式是不同的，其中有的突變頻率很低，不到3%。正是由于第三代測序對長片段及稀有突變的高靈敏度高準確度檢測，重新證實了FLT3的確是有效的藥物靶標。詳細

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第三代測序系統PacBio RS（2011年12月）