國際罕見病日

每年 2 月的最后一天是 “國際罕見病日”。這個特殊的日子，不僅是為了喚起社會對罕見病群體的關注，更是為了推動醫學進步，讓每一個“罕見”的生命都能被看見、被診斷、被治愈。但現實是，超過半數的罕見病患者仍困在“診斷難”的困境里。由于病種繁多、臨床表現復雜，傳統短讀長測序技術對結構變異、單倍型定相等關鍵信息解析力不足，許多患者在漫長的求醫路上輾轉奔波卻始終無法找到病因，最終錯失最佳干預時機。

如今，高精準長讀長 HiFi 測序技術正在打破這一僵局，它憑借“長讀長、高準確度、單分子分辨率”的優勢，不僅能精準捕捉到傳統短讀長測序難以發現的復雜結構變異、重復序列擴增和嵌合突變，還能實現甲基化修飾的直接檢測，為罕見病的病因解析、分子分型和精準治療提供了前所未有的強大工具。

在國際罕見病日到來之際，我們將通過三篇前沿文獻，帶您見證 HiFi 測序如何在臨床診斷、甲基化分析等領域大放異彩，為罕見病患者點亮希望之光。

罕見病難檢變異的精準捕獲利器

背景

傳統短讀長測序難以識別復雜結構變異、串聯重復等難檢變異，需多種互補檢測技術聯用，導致診斷流程繁瑣、成本高昂。本研究聚焦 HiFi 測序在罕見病診斷中的應用，通過 100 份樣本中的 145 個已知難檢臨床相關變異（含 25 例短串聯重復序列擴增、34 例同源序列 / 假基因相關變異、23 例復雜結構變異），驗證其技術優勢與臨床潛力。其中部分樣本經短讀長測序驗證僅 41% 變異可自動檢出。

關鍵研究設計

采用 PacBio Revio 平臺進行HiFi WGS（目標覆蓋度 30×），結合 Hifiasm 、PBSV 等工具進行變異檢測與注釋，同時評估 10×、15×、20× 覆蓋度下的檢測效能。

核心發現

 HiFi 測序展現出卓越的難檢變異捕獲能力：自動檢測率達 83%（120/145），涵蓋結構變異、STR 擴增、SNV / 插入缺失等類型；10%（14/145）變異經人工可視化驗證可識別，總體檢出率 93%（圖1）。相比短讀長測序，同源區域變異、復雜結構重排等檢出效能提升顯著，可成功解析 CEP85L 與 MCM9 基因間 200kb 復雜重排。

圖1. 樣本中可檢出的變異類型（A），不同檢測方法（B）及長讀長測序的檢出情況（C）

 單一技術覆蓋全變異類型：無需多種檢測技術聯用，可同時精準捕獲結構變異、STR 擴增、甲基化相關變異、線粒體變異等，也能區分同源序列/假基因區域變異，結合 T2T 完整參考基因組，還能解決 GRCh38 無法解析的染色體易位等復雜變異，提供更豐富的分子診斷信息。

 低覆蓋度耐受性突出：15× 覆蓋度下 90% 自動檢出變異仍可識別，僅同源區域變異靈敏度略有下降，為臨床規模化應用降低成本提供支撐。

局限與結論

7% （11/145）變異未檢出，主要集中在 GA 基序重復擴增及50kb 以上大片段重復區域的結構變異斷點。未來通過優化變異檢測算法、整合低質量數據的針對性重新利用及靶向測序技術，可進一步突破現有局限。總體而言，HiFi 測序大幅超越傳統短讀長測序的難檢變異識別能力，有望成為罕見病一線診斷技術，簡化流程并提升分子診斷率。

罕見病臨床一線診斷的規模化驗證與突破

背景

短讀長測序需多種互補檢測技術聯用，診斷流程繁瑣，且部分復雜變異難以捕獲。HiFi 測序有望整合現有檢測體系為單一檢測，但缺乏大規模臨床驗證，本研究通過 1000 份臨床樣本平行試驗，評估其一線診斷可行性。

關鍵研究設計

納入荷蘭兩所三級醫學中心 2022 年 1000 份生殖系診斷臨床樣本（含 832 例先證者，84個家系三聯體、748個單例），涵蓋多系統罕見病。同步開展SoC（standard-of-care，標準診療）與基于 HiFi 測序的lrGS（Longread genome sequencing，長讀長基因組測序），對比診斷一致性、新增診斷率，并建模評估將 HiFi 測序作為一線檢測手段對 15150 例年度隊列樣本診斷效率的影響。

核心發現

 lrGS與 SoC 診斷一致性達 96.4%（802/832），3.4% （28/832）的病例實現診斷升級或修正（圖2B、C）：① 檢測到 SoC 遺漏的插入缺失、拷貝數變異（CNV）、結構變異（SV），或精確定位 CNV，將 5 例疑似診斷升級為確診；② 借助單倍型定相信息，明確 21 例隱性遺傳病的突變呈反式排列（確診），2 例呈順式排列（排除致病），大幅優化變異解讀。僅 0.2% （2/832）病例漏檢（圖2B、C）:分別為 GJB2 基因 4% 低水平嵌合 SNV（需靶向深度測序）、TLK2 基因 1bp 新發缺失（lrGS 該位點覆蓋度僅 16×）。

圖2. IrGS與 SoC 的診斷結果對比

 lrGS可將診斷率從 SoC 的 16.5% 提升至 19.2%（圖2B），且單倍型定相能力突出，可對91.4% 的基因內雜合變異對進行定相，≤39kb 的基因相位解析率達 98.7%，定相 N50 達 200kb（遠高于短讀長的0.8kb），無需家系樣本即可區分隱性遺傳病變異排列方式。可單一技術整合遺傳 + 表觀檢測，識別 X 染色體失活偏倚，為變異致病性提供佐證。

 20× 覆蓋度下 SNV/InDel 召回率僅下降 1.1%，僅漏診 1-2 例，SV 召回率下降 3.6%，20× 覆蓋度即可滿足臨床需求，大幅降低檢測成本。建模顯示，應用于 15150 例年度隊列樣本，診斷率可從 16.4% 提升至 18.9%，為超 500 例患者新增確診機會。

局限與結論

對 GA 富集重復序列擴增、低比例嵌合變異等檢測仍有不足，1.1% 的疾病基因存在覆蓋度不足問題。但 HiFi 測序的高一致性、增量診斷價值及規模化潛力，可大幅簡化診斷流程、縮短診斷時間，使其成為罕見病一線診斷的有力選擇。本研究為罕見病基因診斷從“多技術迭代”向“單一長讀長檢測”的轉型提供了關鍵證據。

罕見病甲基化檢測與表觀特征分析的革新工具

背景

DNA 甲基化異常與多種罕見病相關，表觀特征可輔助變異致病性解讀，但傳統檢測方法存在 DNA 降解、覆蓋受限等問題。HiFi 測序可檢測天然 5mC（無需額外 DNA 處理），還能實現變異單倍型定相，為甲基化檢測提供新方案，但缺乏系統的醫學應用驗證。本研究驗證其甲基化檢測與表觀特征分析的臨床價值。

關鍵研究設計

通過 HG002 細胞系對 HiFi 測序與傳統甲基化檢測的一致性進行對比；納入 10 個家系三聯體（30 份樣本），評估 25 個已知親本印記區域檢測準確性及低覆蓋度耐受性；采用 12 例 KMT2A 致病變異患者、2 例 VUS（意義不明確的變異） 樣本及 39 例對照，驗證表觀特征適用性。

核心發現

 HiFi 測序與傳統甲基化檢測的 CpG 位點重合率達 93%，Pearson 相關系數 > 0.9，可多檢測5% 的 CpG 位點，其中 52.5% 位于著絲粒區域、73.4% 位于 ENCODE黑名單區域，彌補了傳統技術在復雜基因組區域的檢測空白；其從頭檢測模式還能發現 4.47% 的新 CpG 位點（含 55837 個 CpG 島位點），這些位點多由基因組變異產生，對調控區域甲基化分析具有重要意義。

 印記區域檢測精準率達 96%（24/25），準確區分父母源等位基因甲基化模式，單區域 CpG 覆蓋量是 450K 芯片的 5 倍，與 WGBS 相當。15× 覆蓋度下，與 30× 參考數據的 Pearson 相關系數達 0.8，支持雙樣本共測降低成本（圖3）。

圖3. PacBio長讀長測序技術對三聯體樣本中25個穩定印記基因組區域的甲基化檢測效能評估

 可直接應用已發表的 KMT2A 表觀特征，精準區分患者與對照，將 2 例 VUS 樣本歸類為對照，為變異致病性重分類提供依據，且能同時捕獲遺傳變異與甲基化信息，簡化聯合診斷流程。

局限與結論

從頭構建表觀特征能力不足，需 300 例以上樣本才能達到 80% 檢測效能；對部分印記區域甲基化差異檢測有欠缺。但 HiFi 測序的天然DNA檢測、廣覆蓋、高精準、可同時提供單倍型定相信息等優勢，克服了傳統技術局限，為罕見病表觀遺傳診斷及變異解讀提供全新解決方案。

三篇文獻從不同維度印證了 HiFi 測序的技術革新價值：聚焦難檢變異捕獲、規模化臨床驗證、表觀遺傳檢測，全方位突破傳統技術瓶頸。HiFi 測序以 “單技術多維度覆蓋、高精準度、低覆蓋度耐受” 為核心特質，能大幅縮短診斷周期、提升診斷率、簡化診療流程，減少患者“Diagnostic  Odyssey（診斷奧德賽）” 的痛苦。在國際罕見病日來臨之際，HiFi 測序正以技術革新之力，讓“罕見”不再“難見”，為全球 3 億罕見病患者點亮精準診療的希望之光。

參考文獻：

https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2024.12.013

https://doi.org/10.64898/2026.01.13.26343759

https://doi.org/10.1186/s13073-025-01506-9

基因有限公司作為PacBio公司中國區合作伙伴，自2011年以來將PacBio第三代單分子實時測序技術引入國內，一直為國內用戶提供專業的三代測序系統的安裝培訓，技術支持，應用培訓與售后維護工作，贏得客戶的一致好評與信任。基因有限公司將一如既往的支持越來越多的PacBio用戶。

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