《ACS Applied Bio Materials》：Phototunable Gelatin-Based Hydrogels as Cell Scaffolds for Modulating Cell Adhesion on Hydrogel Surfaces
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本研究的核心在于設計并合成了一種光響應明膠丙烯酸酯水凝膠，旨在實現對細胞-材料相互作用的精細調控，為組織工程應用提供動態、可調的平臺。通過引入光降解的鄰硝基芐基丙烯酸酯（PDA）到明膠主鏈，該水凝膠在特定波長光照射下能發生可控降解，進而調節人骨髓間充質干細胞（hMSCs）的粘附與鋪展行為。這項研究證實了通過光刺激可以按需、精確地重塑細胞微環境，為發展可動態調控的生物制造技術與再生醫學應用（如血管組織建模）提供了新策略。
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引言
細胞支架旨在模擬體內細胞外基質（ECM）等生物微環境。水凝膠因其高持水性和細胞包封能力而被廣泛應用。立體光刻技術可以實現水凝膠的精準三維（3D）打印，以構建復雜的組織支架模型。為了克服傳統3D水凝膠支架可調性有限的問題，光響應性水凝膠應運而生，其能夠通過光照實現可控降解和性能調節。明膠作為一種源自膠原蛋白的天然聚合物，具有良好的生物相容性和細胞粘附能力，但其水凝膠在生理溫度下通常不穩定。因此，常采用甲基丙烯酸酐改性明膠制成明膠甲基丙烯酸酯（GelMA），通過自由基聚合形成交聯水凝膠。然而，一旦GelMA水凝膠模型打印完成，其物理性能和功能便基本固定，缺乏后續的可調性。為了解決這一問題，研究者開始關注光降解材料，其力學和化學性質可通過光照控制，為構建具有動態調控能力的組織工程平臺提供了可能。本研究的目的是合成一種既保留類似GelMA的3D打印潛力，又允許后續可控降解的明膠基細胞支架水凝膠。
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實驗步驟
2.1. 試劑
所有試劑均購自商業來源并直接使用，包括明膠、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）等。
2.2. 光降解明膠丙烯酸酯（Gelatin-PDA）的合成
參照先前報道的方法合成了鄰硝基芐基丙烯酸酯。Gelatin-PDA的合成是通過明膠的氨基與鄰硝基芐基丙烯酸酯的羧基，在EDC和NHS存在下進行偶聯反應實現的。通過1H NMR譜計算，PDA在明膠中的取代度為99%，表明幾乎所有的賴氨酸氨基都已與PDA反應。通過紫外-可見光譜評估了Gelatin-PDA水溶液在光照下的降解行為，其最大吸收波長隨照射時間（0至180分鐘）從349 nm逐漸降低至316 nm，證實了PDA的光降解。
2.3. Gelatin-PDA水凝膠的制備
通過混合Gelatin-PDA、過硫酸銨（APS）和N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）在杜氏磷酸鹽緩沖液（D-PBS）中的溶液來制備水凝膠前體溶液，并在37°C下聚合20分鐘形成水凝膠。
2.4. Gelatin-PDA水凝膠的光降解
使用365 nm（功率：1.41 mW/cm2）的UV燈和385 nm（功率：18.6 mW/cm2）的數字光處理（DLP）設備進行光照。在365 nm光照射22小時后，15%（w/v）的Gelatin-PDA水凝膠從淡黃色轉變為深棕色流動狀態，表明發生光降解。熒光顯微鏡觀察凝膠橫截面顯示，照射區域出現了藍色熒光層，厚度約200 μm，且熒光強度隨照射時間增加而增強，這證實了凝膠表面區域發生了光降解，降解產物具有熒光特性。傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析顯示，在光照射后，與PDA相關的硝基基團吸收帶強度降低，而明膠主鏈的結構得以保持。
2.5. 細胞培養
人骨髓間充質干細胞（hMSCs）被接種在經光照射和未經照射的Gelatin-PDA水凝膠表面，培養24小時。使用羅丹明鬼筆環肽和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）對細胞骨架和細胞核進行染色，并通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）進行觀察。
2.6. 統計分析
數據以平均值±標準差表示。兩組樣本間的比較采用學生t檢驗或雙因素方差分析，以p< 0.05為具有統計學意義。
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結果與討論
3.1. Gelatin-PDA大分子的光降解行為表征
成功合成了Gelatin-PDA。UV-vis光譜變化證實了其在光照下發生降解，最大吸收波長從349 nm降至316 nm。
3.2. Gelatin-PDA水凝膠的光降解行為表征
光照射導致水凝膠物理狀態和顏色發生改變，表明降解發生。通過熒光顯微鏡觀察橫截面，證實降解主要發生在凝膠表層，深度約200 μm。紅外光譜分析進一步支持光降解發生在PDA部分，而明膠主鏈結構保持完整。
3.3. Gelatin-PDA水凝膠上細胞粘附的調控
細胞實驗表明，當hMSCs接種在光照射的Gelatin-PDA水凝膠上時，細胞的粘附數量減少，而細胞骨架（肌動蛋白）的鋪展面積增加。具體而言，與未照射區域相比，在20%（w/v）水凝膠上，光照射區域的細胞粘附數量減少了約25.1%，但單個細胞的肌動蛋白面積增加了約52.1%。在15%（w/v）水凝膠上也觀察到類似趨勢。這表明光降解改變了水凝膠的表面特性（如剛度），從而影響了細胞的粘附和鋪展行為。進一步使用DLP設備進行微圖案化照射（正方形圖案，照射時間2-10分鐘）后，細胞粘附數量隨照射時間延長呈下降趨勢，說明可以通過精細調節光照參數來調控細胞的生物學行為。
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結論
本研究成功合成了一種光降解的明膠丙烯酸酯（Gelatin-PDA）水凝膠。通過改變Gelatin-PDA濃度和紫外光照射條件（如照射時間、面積），可以對水凝膠表面進行調控，從而影響人骨髓間充質干細胞（hMSCs）的粘附與鋪展行為。將這種Gelatin-PDA水凝膠與先進的三維打印技術（如立體光刻）結合，有望實現對細胞行為的動態、精確調控，為生物制造和再生醫學（如動態細胞遷移、血管組織建模）創建可調的生物微環境開辟了新途徑。未來工作旨在將此技術應用于通過特定波長的光刻技術制造三維水凝膠細胞支架，并利用另一波長的光誘導光降解，實現精確的結構調控。
