作為全球致殘和致死的主要原因之一，缺血性中風對公共衛生構成了沉重負擔。其中，發病后的最初24小時，即“超急性期”或“黃金時間窗”，對患者的長期功能恢復至關重要。盡管當前治療側重于血流恢復，但臨床標準仍將大量患者排除在治療之外。因此，深入理解“黃金時間窗”內的分子、細胞和生理事件，對于開發新的中風療法至關重要。

在神經系統疾病中，突觸功能失調是核心病理因素。雖然突觸可塑性在神經發育和神經退行性疾病的早期病因學中已被廣泛涉及，但其在早期中風中的作用卻鮮為人知。既往研究多關注于離體缺血模型中的廣泛突觸衰竭或中長期的功能適應與康復，而早期突觸重塑過程在很大程度上仍是未知的。為填補這一知識空白，本研究致力于詳細描繪缺血性中風發生后的最早階段的突觸可塑性。

研究首先在培養神經元中探討了氧糖剝奪（OGD，一種經典的細胞缺血模型）對突觸的影響。免疫染色顯示，與對照培養基相比，OGD處理45分鐘內，興奮性突觸后致密區（PSD）標記蛋白Homer的斑點狀標記即出現丟失。同樣，突觸前活性區支架蛋白Bassoon（BSN）和抑制性PSD蛋白Gephyrin的斑點狀染色也呈類似減少。OGD對抑制性突觸的影響比興奮性突觸更強。2小時的OGD處理后，部分突觸標記物的斑點數減少，斑點間最近鄰距離增加，反映了突觸的丟失。這表明，缺血導致了培養神經元中突觸的快速解離。

為更全面地模擬中風病理生理學，研究采用了可較好再現人類中風形態和生理特征的大鼠永久性大腦中動脈阻塞（MCAO）模型。正如預期，MCAO可靠地在皮層產生大面積壞死病灶。在缺血核心區，所有三種突觸標記物在MCAO后4小時內均表現出顯著下降，這與OGD模型的觀察結果一致，表明缺血與興奮性和抑制性突觸的快速破壞有關。在半暗帶，Homer的斑點也減少了。MCAO還降低了缺血核心區和半暗帶中聚合的F-肌動蛋白（F-actin）的突觸水平，這支持了快速突觸重塑的觀點。這些發現共同證明，中風能迅速導致缺血核心區的深度突觸丟失以及半暗帶的某些突觸減少。

中風后的中長期恢復過程已知涉及全腦功能連接的重新塑造。為研究超急性中風對突觸可塑性的長程影響，研究測量了中風對遠離缺血核心區（0.5-1厘米）的對側皮質中突觸標記物的影響。引人注目的是，MCAO后僅1小時，對側皮質的Homer和BSN斑點狀染色就顯著增加。而Gephyrin斑點并未伴隨增加，表明結構性突觸增大可能僅限于興奮性突觸。Homer和BSN陽性斑點的數量沒有顯著改變，這與現有突觸的增大而非新突觸的生成相符。

為更深入了解中風期間的快速突觸重塑，研究對幾類關鍵的突觸蛋白進行了免疫染色。對于突觸后受體，研究了AMPA型谷氨酸受體亞基GluA2和GABA受體亞基GABRA1的分布。OGD在15分鐘和45分鐘內分別導致GluA2和GABRA1斑點的快速丟失。在MCAO模型中，也觀察到了類似結果：核心區的GluA2和GABRA1分別在1小時和4小時內減少；在對側皮質或半暗帶未觀察到顯著變化。這些數據表明局部缺血導致了突觸后功能的快速下降。

為研究中風對突觸前結構和功能的影響，對腦切片進行了P/Q型電壓門控Ca²⁺通道（VGCC）Ca_V2.1和突觸小泡（SV）標記蛋白囊泡谷氨酸轉運體vGlut1的免疫標記。研究發現MCAO不影響Ca_V2.1的染色，而vGlut1在缺血核心區4小時后增加。為直接測量突觸前功能，在MCAO后制備急性腦切片，并使用針對突觸小泡標記蛋白Synaptotagmin 1（Syt1）胞外域的抗體進行活體標記。抗Syt1標記在核心區和半暗帶均顯著減少。這些發現共同表明，缺血快速下調了局部的突觸前和突觸后功能。

研究旨在確定超急性中風時長程突觸可塑性的信號機制。N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）是包括中風在內的神經系統疾病中突觸可塑性的關鍵調節因子。基于先前關于缺血期間NMDAR表達的線索，對OGD和MCAO后突觸NMDAR的分布進行了成像。OGD對必需NMDAR亞基GluN1的突觸水平沒有顯著影響，在MCAO期間，整個大腦區域的GluN1水平也沒有顯著變化；對于另一個與中風和神經保護相關的NMDAR亞基GluN2B也觀察到類似結果，這表明超急性中風的時間尺度與突觸NMDAR的募集無關。

為研究NMDAR信號對突觸重塑的功能相關性，研究人員給動物注射了NMDAR拮抗劑MK801（在該模型中具有神經保護作用），然后進行MCAO，并對Homer和BSN進行染色。在MCAO前注射MK801導致半暗帶和對側半球的Homer斑點狀染色均減少，有效地逆轉了對側半球的長程增加；BSN染色也觀察到類似結果。這一證據表明，NMDAR信號在超急性中風期間以區域特異性的方式協調著全腦范圍內的快速突觸重排。

為更廣泛地了解超急性中風期間的突觸動力學，研究利用定量蛋白質組學鑒定了經過4小時MCAO后，經生化純化的腦突觸體中差異表達的蛋白質。主成分分析（PCA）顯示，缺血核心區和半暗帶在一側，對照和對側皮質在另一側，這表明中風在直接受缺血影響的區域引起了突觸組成的深刻變化。來自核心區和半暗帶的突觸體，其下調蛋白質的數量遠多于上調蛋白質（分別為580對210和373對146），這與缺血中普遍的突觸減少一致。而在對側突觸體中，上調和下調的蛋白質數量相似（88對93），這與突觸重塑的觀點一致。區域表達譜之間存在一定重疊，表明出現了全腦性以及局部的反應。

研究更詳細地關注了對側突觸重組。基因本體（GO）分析顯示，在與突觸可塑性相關的生物過程和分子功能術語方面有富集，而頂級的細胞成分術語則與突觸定位相關。這些結果通過基因集富集分析（GSEA）得到證實，返回了與突觸前膜運輸相關的術語。相比之下，下調蛋白質的GO術語更為多樣，通常與代謝和膜運輸有關，在細胞成分類別中細胞核顯著富集，表明可能存在位于細胞核的非突觸反應。在88個上調蛋白質中，有35個先前被GO術語與突觸相關聯，包括突觸后功能、突觸前釋放、離子轉運和細胞外粘附，其中電壓門控K⁺通道增加尤為顯著，這是神經元興奮性和突觸可塑性的關鍵調節因子。增加最多的蛋白質是β-突觸核蛋白（β-Synuclein），先前曾被建議作為中風的生物標志物。其他值得注意的上調蛋白包括中間絲的主要蛋白波形蛋白（vimentin），以及與內源性大麻素信號相關的9種蛋白質，包括負責2-花生四烯酸甘油（2-AG）代謝的兩種酶Mgll和Dagla。這些證據共同證實了在超急性中風期間對側半球的突觸上調。

相反，在缺血核心區和半暗帶未觀察到突觸增加。在核心樣本中，上調的GO術語富集于質膜定位，而下調的術語是細胞核和細胞質，這可能表明由于缺血誘導的壞死導致了細胞區室崩解造成的污染。在半暗帶的GO分析表明，線粒體中的脂肪酸β-氧化上調，而細胞質中的翻譯下調。

為研究對側皮質的突觸前功能，將活體標記抗Syt1測定應用于突觸體。鑒于先前證據顯示本構性突觸小泡循環沒有增加，研究采用高K⁺去極化來測量誘發性突觸小泡循環。用抗Syt1對突觸體進行表面標記顯示假手術對照組和MCAO組之間沒有差異，表明Syt1的表面水平沒有變化。然而，用30 mM KCl處理導致從MCAO對側皮質純化的突觸體信號顯著更高，表明誘發性突觸小泡循環增加。這些數據證實了中風對全腦突觸前功能的長程影響。

研究數據揭示了響應超急性中風的區域特異性突觸重組模式。為揭示相關的基因表達動力學，研究人員從全腦組織和突觸體中分離、測序并分析了總RNA。全腦組織數據的PCA顯示出顯著的離散性，這與腦基因表達的個體間變異性一致。相反，突觸體樣本的PCA返回了對照、缺血核心區和半暗帶之間的清晰分離，表明中風觸發了大規模、獨特的、區域特異性的突觸基因表達程序的產生，而對照和對側樣本重疊，表明基因表達譜差異很小。

研究首先對突觸體進行了基因集變異分析（GSVA），使用了先前發表的突觸基因集。在對側半球樣本中未觀察到變化，這表明對側半球的突觸重塑可能不是由局部基因表達驅動的。相反，來自缺血核心區的樣本顯示突觸后基因集的特定下調，而來自半暗帶的突觸體中的大多數突觸基因集都下調，表明了對局部突觸基因表達的影響。對突觸基因集的影響在半暗帶的全腦樣本中也很明顯。

為了進一步了解早期中風期間受基因表達調控的生物學過程，研究使用基因本體（GO:BP, GO:MF, GO:CC）和KEGG術語進行了GO分析。在半暗帶，上調基因參與各種生物過程的調節，主要與發育和免疫反應相關，突出了對中風反應的廣泛重組，而下調的術語包括突觸和細胞間通訊，這與GSVA結果一致。在對側半球，突觸體和全腦組織的基因分別在與代謝過程和補體系統相關的術語上顯示出上調。在缺血核心區，全腦組織中下調的基因在轉錄相關術語中富集，而突觸體中下調的基因則在突觸和細胞粘附相關的術語中富集。綜上所述，研究數據表明超急性中風誘導了廣泛的區域特異性基因表達程序。

本研究的關鍵發現是中風對對側半球興奮性突觸的影響，出現在中風發作后4小時內。先前發表的關于2天以上對側功能改變的證據尚無定論，這表明對側增強可能是與中風超急性期特別相關的短暫特征。將突觸功能從核心區/半暗帶重新定向出去，可能代表了一種早期階段的反應機制，以保障全腦功能。在更長的時間尺度上，遠端大腦活動的增加可能提供刺激，促進中風區域環路的功能恢復。對側上調的廣泛彌漫性質讓人聯想到一種穩態機制，其時間尺度類似于氯胺酮和鋰誘導的可塑性，其作用先于中風較慢的長程神經元可塑性。我們的蛋白質組學和轉錄組學分析突出了與長程突觸可塑性相關的特定功能，包括膜電位、大麻素信號和突觸前功能，后者已通過實驗直接證實。考慮到研究調查的時間尺度有限，在調查中發現的88個對側上調蛋白質可能只是隨后更廣泛變化的先兆。在對側半球觀察到的有限基因表達變化表明，突觸重塑可能以跨腦的方式從缺血核心區和半暗帶產生影響，在這兩個區域，我們發現了一個以代謝重組和突觸下調為中心的轉錄/翻譯反應。類似的代謝轉換，即減少蛋白質生物合成和增加脂質代謝，先前已在心臟中得到證實，這表明對缺血的代謝適應存在廣泛的共性。考慮到突觸傳遞的巨大能量需求，可以推測區域突觸重塑和代謝轉換可能協同作用，以在中風期間平衡功能與組織活力。

有趣的是，長程突觸效應的發現喚起了“神經功能聯系不能”（diaschisis）的概念，即指局部腦損傷導致遠端大腦區域的功能變化。在這一框架下，突觸可塑性可被解釋為神經功能聯系不能的基質，為中風的廣泛腦效應提出了新的機制。長程突觸反應是否在創傷、腫瘤或感染導致的其他形式的腦損傷中發揮類似作用，仍有待觀察。

研究表明，全身性給予NMDAR拮抗劑MK801會破壞MCAO誘導的突觸重塑，突顯了NMDAR在協調早期中風全腦代償性突觸反應中的關鍵作用，并揭示了NMDAR在腦部疾病中所扮演的復雜作用的一個新方面。與MCAO期間核心區和半暗帶細胞外谷氨酸濃度快速增加的報道一致，NMDAR的激活可能局限于缺血區域。有趣的是，數據顯示，在NMDAR阻斷期間進行MCAO會導致對側突觸減少，這表明中風中的NMDAR信號可能不僅啟動了一條用于突觸增強的長程通路，而且還抑制了另一條用于突觸弱化的機制。關于MK801對體溫缺乏影響的情況，在MK801處理的假手術對照組中觀察到的突觸染色增加與NMDAR阻斷觸發的快速增強一致，而非發熱誘導的突觸增強。由于NMDAR在大腦中的廣泛表達譜，證據無法單獨評估突觸、突觸外或非神經元NMDAR的貢獻，它們可能在中風中以不同方式參與；因此，NMDAR對這種長程中繼的相關性值得進一步研究。

蛋白質組學分析提示了另一條信號通路在突觸再平衡中的可能作用，即大麻素信號通路。對側半球大麻素信號成分的突觸表達增加，可能通過多種形式的可塑性來調節突觸動力學，而半暗帶突觸中大麻素受體1水平的增加可能促進先前與中風相關的促生存通路的激活。廣泛的突觸重塑可能與介導大麻素神經保護特性的局部機制協同作用，增強大腦對中風的整體恢復力。

研究的主要局限性涉及特定中風模型的使用。永久性MCAO模型雖然被中風治療學術產業圓桌會議推薦，但無法涵蓋人類中風的多個關鍵特征，最顯著的是其病理生理異質性，以及缺血和內皮損傷過程之間復雜且知之甚少的相互作用。因此，本研究的結果為在其他動物中風模型以及最終在人類患者中進行進一步研究提供了依據，需要特別注意年齡和性別等因素。

由于實驗設計的考慮，研究重點關注了1、2和4小時的時間點，這與臨床對超急性中風的普遍定義一致。因此，沒有考慮更快或更慢形式的突觸動力學，例如赫布可塑性或小膠質細胞的吞噬作用。涵蓋更廣泛時間尺度的擴展調查可能會提供中風突觸動力學更詳細的圖景；就此而言，對即早期突觸重塑的研究可能適用于活體成像方法，以更近距離地觀察臨床上重要的中風第1小時。

對側突觸前末梢突觸小泡循環增強的證據，需要對觀察到的效應進行更詳細的功能評估。雖然突觸小泡測定代表了評估一般突觸功能的有效指標，但突觸在腦部疾病中的性質可能很復雜，其不同功能方面受到不同程度的影響。此外，長程突觸重塑在多大程度上構成代償機制與中風后遺癥仍不清楚。需要對超急性中風的全腦突觸功能進行專門的系統性研究來解決這些問題。

本研究的結果提出了許多關于早期中風突觸可塑性的問題。代謝反應如何與突觸重組相耦合？衰老如何影響中風誘導的突觸動力學？快速突觸重塑的哪些方面有助于大腦對中風的反應，哪些又代表了其不良后果？在更廣泛的背景下，早期突觸參與的構想與關于其他腦部病理學的既定論述相一致，為在腦血管疾病（包括創傷性腦損傷、短暫性腦缺血發作和出血性中風等急性神經系統疾病）中進一步研究突觸可塑性提供了動力。

研究結果的臨床相關性仍有待確定，因為缺乏關于早期人類中風突觸動力學的證據。雖然在臨床環境中直接研究人腦突觸在實驗上仍然具有挑戰性，但最近發表的關于中風對側功能增強的腦電圖證據表明，類似的機制可能在人腦中起作用。經過進一步研究，從長遠來看，靶向突觸可塑性可能為改善中風“黃金時間窗”內及以后的臨床結果提供急需的新治療方式，這與治療神經退行性和神經發育疾病早期階段的新興突觸療法相平行。