《Critical Reviews in Analytical Chemistry》：Analytical Approaches for the Identification and Characterization of Tannins in Natural Matrices. A Comprehensive Review
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這篇綜述系統地評估了在天然復雜基質中鑒定和表征結構多樣的植物多酚——單寧的分析策略，并提出了一種與分析目標相匹配的分步工作流程。文章從快速的定性篩選技術（如點滴試驗、顯微鏡）推進到結構導向的先進方法（如色譜、質譜、核磁共振），并強調了整合互補技術和化學計量學，而非依賴單一方法。作者比較了不同方法的原理、成本、速度、靈敏度、選擇性和重現性，旨在為可持續工業應用、綠色化學、法規遵從和文物保護科學（尤其是在需要微損分析的情況下）提供分析決策支持。
單寧的重要性與挑戰
單寧是一類結構多樣的植物來源多酚化合物，廣泛存在于樹皮、木材、葉子、果實和藻類等多種植物組織中。這些次級代謝產物以其廣泛的生物活性和多樣的化學特性，在食品、制藥、材料、環境和文化遺產等多個領域展現出日益增長的重要性。然而，其復雜的化學結構對常規分析構成了持續挑戰。從鞣制皮革、紡織品染色、制備墨水，到在醫藥中發揮收斂、抗炎、抗菌和促進傷口愈合的作用，單寧的應用歷史悠久。盡管隨著合成染料和化學工藝的興起，單寧在紡織等行業的使用有所減少，但人們對可持續實踐和天然材料的重新關注正在推動其復興。在皮革工業中，單寧基工藝正在替代鉻鹽和醛類等有害化學品，從而提升可持續性并適應不斷演化的環境與倫理標準。此外，單寧在藥學、醫學和化妝品領域的應用研究不斷深入，其抗氧化、抗炎、抗菌活性的機制正被更好地理解，為其在代謝性疾病、心血管疾病、癌癥和神經退行性疾病中作為治療劑開辟了新的研究方向。在葡萄酒行業，單寧對澀感、顏色穩定性、天然防腐以及陳釀過程中風味發展起著關鍵作用。在農業和動物營養領域，單寧被研究用于改善反芻動物消化效率和減少甲烷排放。單寧還可作為水處理中的天然絮凝劑，通過絡合和沉淀去除重金屬和有機污染物，并被探索用于生物降解塑料和作為木材加工業中甲醛基粘合劑的可持續替代品。因此，準確鑒定和表征單寧對于優化其應用、理解其生物功能以及評估其環境影響至關重要。
單寧的化學性質與分類
單寧是高分子量化合物（通常在500至20 kDa之間），含有多個酚羥基，可通過氫鍵和疏水相互作用與蛋白質、碳水化合物等大分子形成復合物。根據化學結構、生物合成來源和水解行為，單寧被廣泛分為五類：水解單寧、縮合單寧、復合單寧、葉狀單寧和擬單寧。
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水解單寧 由一個中心葡萄糖或多元醇核與沒食子酸（沒食子單寧）或六羥基聯苯二酸（鞣花單寧）酯化而成，可被酸、堿或酶水解，釋放出沒食子酸或鞣花酸。
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縮合單寧，也稱為原花青素，是黃烷-3-醇單元（如兒茶素和表兒茶素）的聚合物，通過C4→C8或C4→C6黃烷間鍵連接，形成高度穩定的結構，抵抗水解。
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復合單寧 結合了水解單寧和縮合單寧的特征，包含一個共價連接到黃烷-3-醇或黃烷-3,4-二醇單元的水解部分。
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葉狀單寧 是棕藻特有的多酚化合物，由間苯三酚單體通過芳基-芳基鍵連接形成。
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擬單寧 是非聚合化合物，能模擬單寧的特性（如蛋白質沉淀和澀感），但缺乏真正的多酚結構，例如沒食子酸衍生物和單體兒茶素。
分步分析路徑
對單寧進行系統表征的策略始于快速篩選，逐步推進到結構導向方法。分析技術的選擇基于成本、速度、靈敏度以及所需信息的類型（定性、半定量或定量）。一個典型的工作流程包括：
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初步篩查與定性分析：使用點滴試驗、光學顯微鏡、熒光/共聚焦拉曼顯微鏡或掃描電子顯微鏡結合能譜分析等技術，確認單寧的存在、分布或形態。
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半定量分析：使用直接紫外-可見光譜、傅里葉變換紅外/近紅外光譜、熱重分析或差示掃描量熱法等技術，估算單寧水平。
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定量分析：
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a) 使用紫外-可見分光光度法結合標準曲線測定總單寧含量。
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b) 使用高效液相色譜-二極管陣列檢測或高效液相色譜-質譜聯用技術結合標準曲線，準確定量單個組分。
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c) 使用高效液相色譜-質譜或基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜進行痕量分析。
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結構解析：使用核磁共振、熱裂解-氣相色譜-質譜、質譜或凝膠滲透色譜等技術，鑒定單寧結構、功能基團，并估算分子量分布和聚合物尺寸。
單寧鑒定與表征技術
初步篩查技術 - 點滴試驗
這些是基于單寧與特定試劑反應產生可見變化（如顏色變化或沉淀）的定性方法。標準點滴試驗包括三氯化鐵（根據單寧類型產生藍色、綠色或黑色）、香草醛-鹽酸和酸性丁醇（對縮合單寧呈紅色/深紅色）、金匠皮測試（檢測蛋白質結合能力）以及沉淀試驗（如明膠試驗）。由于其結果是純視覺和定性的，這些測試應與儀器方法結合使用以確保可靠的單寧表征。
空間定位與元素分析 - 顯微鏡技術
顯微鏡能夠對單寧的定位、積累和生物功能進行多尺度研究。
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光學顯微鏡 常與經典組織化學染色方案結合使用，如香草醛-鹽酸染色（用于縮合單寧，產生紅色反應）和三氯化鐵染色（可區分水解單寧和縮合單寧）。
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熒光顯微鏡 利用單寧的自然自發熒光或特定熒光試劑增強的熒光，實現更靈敏、高分辨率的可視化。例如，在花旗松心材中，多黃酮單寧在488 nm激發后顯示出特征性的橙色發射。
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共聚焦拉曼顯微鏡 結合了共聚焦成像的空間精度和拉曼光譜的分子指紋識別能力，提供無標記、化學特異性成像。例如，在橡木心材中，它定位了源自鞣花單寧的晶體鞣花酸。
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掃描電子顯微鏡結合能譜分析 提供單寧沉積物及其元素環境的高分辨率成像，可用于闡明植物特定組織中單寧-金屬的關聯，也可用于文化遺產物品中單寧的識別。
熱分析與量熱法
熱重分析、熱重分析-質譜聯用和差示掃描量熱法用于評估水解單寧和縮合單寧的熱穩定性。
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熱重分析 測量樣品在受控加熱過程中的質量損失，揭示分解途徑。單寧的熱降解通常經歷四個主要階段：水分蒸發、低分子量酚類降解、單寧聚合物骨架降解以及最終降解和碳化。
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熱重分析-質譜聯用 可識別加熱過程中釋放的揮發性降解產物，從而區分水解單寧和縮合單寧。
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差示掃描量熱法 測量受控溫度程序期間化學反應或物理過程產生的熱量變化。水解單寧通常在180–250°C之間顯示出與酯鍵斷裂相關的吸熱轉變，而縮合單寧則在200–400°C之間顯示出廣泛的放熱峰。
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微量差示掃描量熱法 可用于測量膠原-植物單寧基質中的膠原變性，描述和量化歷史皮革的損傷，并評估現代皮革中鞣制工藝的功效。
中間分子技術 - 光譜法用于結構類別識別、定量和表征
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紫外-可見光譜 可用于快速估算樣品中的總單寧和酚類含量（例如，葡萄酒在280 nm處的吸光度）。選擇性可通過使用形成有色復合物的化學試劑來增強。然而，它主要提供整體信息，而非詳細的結構見解。
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傅里葉變換紅外光譜 可檢測分子振動轉變。單寧的多個官能團在光譜中產生特征吸收帶。衰減全反射附件可實現固體或液體樣品的直接分析。傅里葉變換紅外光譜可以根據光譜特征區分單寧類別，并提供比紫外-可見光譜更詳細的結構信息。
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近紅外光譜 監測C-H、O-H等鍵的倍頻和合頻振動帶。盡管信號較弱且重疊較多，但近紅外光譜穿透深度更大，通常無需樣品制備，適用于在線分析。然而，其光譜高度復雜，缺乏特定化學基團的明顯峰，因此量化通常依賴于針對既定方法校準的化學計量學模型。
化學計量學數據分析
鑒于來自復雜單寧樣品的光譜數據信息豐富，化學計量學對于充分利用這些技術至關重要。常用方法包括用于無監督模式識別的主成分分析和層次聚類分析，以及用于構建定量預測模型的偏最小二乘回歸。在單寧分析中，主成分分析和層次聚類分析有助于根據光譜檢測樣品的自然分組或差異，從而實現按單寧類型或來源進行聚類。偏最小二乘回歸將光譜變化與測量的單寧參數相關聯，從而能夠從新的光譜數據預測這些參數。
用于單寧定量和表征的比色法
比色法是定量或半定量的分光光度法，通過單寧與各種試劑反應形成顏色的強度來測量單寧濃度。
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樣品制備：通常涉及用溶劑（如水、甲醇或緩沖液）溶解或提取單寧樣品。索氏提取和室溫浸漬是常用方法。在整個提取過程中，避免光照和最小化水解單寧的水解條件至關重要。
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總酚含量：常用福林-肖卡法或普魯士藍法測定。福林-肖卡法基于在堿性介質中還原鉬和鎢，形成藍色復合物；普魯士藍法則涉及Fe3+還原為Fe2+并形成普魯士藍。
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總單寧含量：可利用單寧與聚乙烯聚吡咯烷酮形成不溶性復合物的能力，通過重量法測定。單寧-聚乙烯聚吡咯烷酮復合物被分離后，測量上清液中的“非單寧”酚類，總單寧含量計算為原始總酚含量與此非單寧部分的差值。
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總縮合單寧含量：通常使用香草醛法和丁醇-鹽酸法測定。香草醛法中，原花青素在酸性介質中與香草醛反應形成有色復合物；丁醇-鹽酸法則將縮合單寧解聚為花青素。
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總黃酮含量：通常使用氯化鋁比色法測定，該法利用Al(III)與黃酮羥基/酮基形成復合物。
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抗氧化能力：可通過分光光度法測定，包括1,1-二苯基-2-三硝基苯肼法、2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸法、鐵離子還原抗氧化能力法和磷鉬酸鹽法，它們基于不同的氧化還原機制，可提供關于自由基清除和還原能力的補充信息。
綜合分離與鑒定 - 聯用色譜技術
聯用色譜技術將分離方法與先進的檢測系統相結合，提供卓越的靈敏度、特異性以及全面的分子信息。
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高效液相色譜-質譜聯用 / 高效液相色譜-二極管陣列檢測：適用于分析極性復雜混合物中的單寧。高效液相色譜-質譜聯用可根據精確質量、質譜圖和裂解模式區分水解單寧和縮合單寧。高效液相色譜-二極管陣列檢測則利用單寧的特征紫外-可見吸收光譜，實現定性和定量分析。
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氣相色譜-串聯質譜：結合了氣相色譜的分離能力和串聯質譜的高靈敏度、選擇性檢測。由于單寧主要是非揮發性和熱不穩定的，需要適當的衍生化來增強其揮發性和穩定性。常用衍生化技術包括烷基化、酰化和硅烷化。
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熱裂解-氣相色譜-質譜：可直接分析復雜基質中的單寧，具有樣品需求量少、無需樣品預處理和重現性高的優點。原位硅烷化等方法有助于區分游離單體和聚合單寧。
應用領域
所述分析技術已廣泛應用于多個領域：
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植物材料和提取物：用于關聯化學成分與生物活性，支持植物生物活性物質的標準化評估。
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食品和飲料：在葡萄酒分析中，高效液相色譜是定性和定量分析單寧的主要方法，用于區分單體、三聚體和聚合形式。電化學方法可用于區分單寧類型和評估抗氧化特性。
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文化遺產：單寧分析有助于了解文物成分、起源、制造工藝、歷史背景、降解途徑和保護策略。分析方法分為侵入式和非侵入式。非侵入式方法包括衰減全反射傅里葉變換紅外光譜、熒光光譜、拉曼光譜、近紅外光譜和便攜式核磁共振等，可在不損壞文物的情況下進行現場分析。
總之，單寧的分析需要一種綜合、分步的策略，根據具體的分析目標選擇和整合適當的技術。隨著分析方法的不斷進步，對單寧結構-活性關系的理解將繼續加深，從而推動生物技術、材料科學和綠色化學等領域的創新發現。
