《Nature Communications》：Reversible surface modifications of functional proteins for accelerated cytosolic delivery via cell-penetrating peptide clusters
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細胞內功能性蛋白質的精準遞送是生物醫學領域的長期挑戰，但遞送效率與可遞送蛋白種類有限。本研究開發了一種新策略：通過用陰離子肽斑塊可逆修飾蛋白表面，使其能與陽離子細胞穿膜肽簇TAT3產生協同靜電作用，從而將多種不同分子量(~1.5 kDa至430 kDa)和等電點(pI<5至>9)的功能性蛋白高效遞送入活細胞胞質。該方法成功應用于遞送攜帶翻譯后修飾(PTM)的合成蛋白探針，有助于原位繪制細胞內PTM介導的相互作用組，并為植物組織等更具挑戰性的系統提供了蛋白質遞送新方案，有望拓寬定制和治療性蛋白質的胞內應用。
在生命科學的微觀世界里，科學家們一直夢想著能夠像快遞員一樣，將各種功能強大的“蛋白質包裹”精準、高效地投遞到活細胞的“內部辦公室”——細胞質中。這項被稱為“胞質蛋白質遞送”的技術，是研究細胞內生命過程、診斷疾病乃至開發新型療法的關鍵。想象一下，如果我們能將定制的抗體、酶或信號蛋白直接送入細胞內部，就能像“特工”一樣干預特定的生物過程，或像“偵探”一樣標記和追蹤重要的分子靶點。然而，現實中的“遞送”之路卻布滿荊棘。細胞膜這層堅固的“保安系統”牢牢守護著細胞的內部，大多數外源性蛋白質都被拒之門外。雖然以HIV-1轉錄反式激活因子(TAT)為代表的細胞穿膜肽(CPP)被發現能夠攜帶貨物進入細胞，但往往效率低下，且貨物容易被困在名為內體的小泡中，無法抵達最終目的地——細胞質。
近年來，將多個TAT串聯形成的“TAT簇”在遞送功能性抗體方面取得進展，能夠在低濃度下實現無毒性的胞內遞送。但這套“快遞系統”仍然存在明顯的局限性：它似乎對“貨物”非常挑剔，成功遞送的蛋白質種類有限，許多分子量過大、等電點(pI)不合適的功能性蛋白依然難以被高效運送。這極大地限制了我們利用蛋白質工具探索和調控細胞的能力。為了突破這一瓶頸，一項新的研究應運而生，旨在開發一種更通用、高效的蛋白質胞質遞送平臺，讓更多種類的“蛋白質特工”能夠順利上崗。
研究人員獨辟蹊徑，不再僅僅優化“快遞員”（遞送載體），而是巧妙地對“貨物”（目標蛋白質）本身進行臨時“包裝”。他們的核心策略是：對需要遞送的功能性蛋白質進行可逆的表面修飾，給它們貼上帶負電荷的“陰離子肽斑塊”。這些臨時貼上的負電“標簽”，能夠與帶正電的“快遞員”——陽離子細胞穿膜肽簇TAT3產生強烈的協同靜電相互作用。這種增強的相互作用，如同為貨物和快遞員之間增加了特制的“魔術貼”，使得兩者結合得更緊密、更高效，從而顯著促進整個復合物穿過細胞膜，并將蛋白質貨物成功釋放到細胞質中。為了驗證這一策略的普適性，研究團隊進行了一系列嚴謹的實驗。
本研究主要采用了以下關鍵技術方法：利用蛋白質工程手段對目標蛋白進行可逆的陰離子肽斑塊表面修飾；使用陽離子細胞穿膜肽簇TAT3作為遞送載體，依靠其與修飾后蛋白間的協同靜電作用實現復合物形成與胞內遞送；通過活細胞成像、流式細胞術和共聚焦顯微鏡等技術定量評估蛋白質的胞質遞送效率與定位；在多種哺乳動物細胞系以及具有完整細胞壁的植物組織樣本中驗證遞送策略的通用性；構建并遞送攜帶特定翻譯后修飾(PTM)的合成蛋白探針，用于原位研究PTM介導的蛋白質相互作用。
蛋白質表面修飾促進與TAT3的協同相互作用
研究人員首先證實，用陰離子肽可逆地修飾蛋白質表面，能夠顯著增強其與陽離子TAT3簇的靜電結合。這種修飾是動態可逆的，意味著在完成遞送任務后，“包裝”可以被移除，從而恢復蛋白質的天然功能和活性，避免了對蛋白質本身功能的長期干擾。
廣泛蛋白質貨物的高效胞質遞送
該策略展現了驚人的通用性。研究成功將分子量范圍極廣（從約1.5 kDa的小肽到430 kDa的巨大蛋白復合物）且等電點(pI)各異（從小于5的酸性蛋白到大于9的堿性蛋白）的多種功能性蛋白質遞送進了活細胞的細胞質。這包括那些之前用傳統TAT簇方法難以遞送的蛋白質，證明了該方法極大地擴展了可遞送蛋白質的“貨品清單”。
在具有細胞壁的植物組織中實現蛋白質遞送
除了動物細胞，研究還將該技術應用于更具挑戰性的植物系統。植物細胞外有一層堅固的細胞壁，是遞送大分子的額外屏障。令人印象深刻的是，這種基于可逆修飾的策略成功實現了蛋白質在植物組織中的遞送，為植物生物學研究和農業生物技術提供了新的工具。
用于繪制翻譯后修飾介導相互作用組的探針遞送
為了展示該方法在前沿生物學研究中的應用潛力，研究人員合成了攜帶特定翻譯后修飾(PTM)，如磷酸化、乙酰化、甲基化、琥珀酰化、巴豆酰化和乳酸化的蛋白探針，并將其遞送入細胞。這些探針能夠像“分子誘餌”一樣，在細胞內原位捕獲與特定PTM修飾相互作用的蛋白質，從而幫助繪制復雜的“PTM介導的相互作用組”，為了解PTM如何調控細胞信號網絡提供了強大手段。
這項研究開發并驗證了一種通用的、基于蛋白質可逆表面修飾的胞質遞送新策略。其核心結論是：通過為蛋白質貨物臨時添加陰離子肽“標簽”，可以極大地促進其與陽離子細胞穿膜肽簇TAT3的協同靜電結合，從而高效、廣泛地將多種不同理化性質的功能性蛋白質遞送入活細胞的細胞質，甚至突破植物細胞壁的屏障。該方法的關鍵優勢在于其可逆性（修飾可移除，恢復蛋白天然功能）、通用性（適用于極寬分子量和pI范圍的蛋白）和應用拓展性（可用于動物和植物細胞，并能遞送復雜的合成蛋白探針）。
研究的深刻意義在于，它巧妙地繞過了單純優化遞送載體的傳統思路，通過對貨物進行可逆“改造”來破解遞送難題，為胞內蛋白質遞送領域提供了全新的視角和強大的平臺性工具。這不僅極大地豐富了可用于胞內操作的蛋白質工具箱，使得更多定制化的治療性蛋白（如抗體、酶、轉錄因子）和用于基礎研究的探針蛋白能夠被派往細胞內“執行任務”，更開辟了在植物系統中進行蛋白質操作的新途徑，并對在體、原位研究翻譯后修飾(PTM)等精細的細胞調控機制具有重要價值。該成果有望加速蛋白質藥物、細胞療法以及基礎生命科學研究的進程。
