干擾素基因刺激因子（STING）是先天免疫通路的關鍵組成部分，能在檢測到來自外來病原體或腫瘤細胞的胞內DNA時，激活I型干擾素（IFN）反應。STING信號傳導對于抗病毒免疫至關重要，并可被利用來驅動抗腫瘤免疫反應。然而，STING的激活需要精準且受控的激動作用，以在腫瘤微環境（TME）中驅動免疫激活，同時避免有毒的全身性免疫激活。事實上，非靶向的小分子STING激動劑療法在臨床上顯示出有限的抗腫瘤活性，這很可能歸因于其半衰期短且在TME內滯留性差。本研究假設，通過抗體偶聯藥物（ADC）將強效的STING激動劑負載直接靶向遞送至TME，可能克服這些局限性。本研究報告了一種具有非可裂解連接子-負載（ncSTING）的新型STING激動劑ADC的開發。采用此連接子-負載的腫瘤靶向ADC（ncSTING ADC）在多種臨床前小鼠腫瘤模型中引發了強大的抗腫瘤活性。研究發現，Fcγ受體（FcγR）結合會影響抗腫瘤活性，因為在部分腫瘤模型中，具有野生型（WT）Fc的ADC比具有FcγR結合突變型Fc的ADC驅動了更強的抗腫瘤活性。此外，與系統性給予釋放的負載相比，腫瘤靶向的ncSTING ADC在引發腫瘤消退的同時，減少了全身性免疫激活。總之，這些數據為通過ADC靶向遞送強效STING激動劑負載提供了治療學依據。

ADC是一種經過臨床驗證的治療模式，它利用腫瘤導向性抗體將強效藥物負載靶向遞送至TME。目前所有FDA批準的ADC均采用通過以下兩種機制之一誘導細胞周期停滯和后續凋亡性腫瘤細胞死亡的細胞毒性負載：（i）微管破壞（例如美登素類和奧瑞他汀類）或（ii）DNA損傷（例如喜樹堿類、吡咯并苯二氮卓類或卡奇霉素類）。這些機制主要靶向分裂的腫瘤細胞，并且通常對非增殖性或耐藥性腫瘤療效有限。為了服務對這些負載耐藥或無效的腫瘤患者，需要具有差異化作用機制的新型負載。新興策略包括直接殺死腫瘤細胞的細胞毒性負載（例如轉錄和翻譯抑制劑）以及引發免疫介導的腫瘤細胞殺傷的免疫刺激性負載。

癌癥免疫療法的目標是通過抑制免疫檢查點（例如抗PD-(L)1藥物）和/或激活免疫刺激通路（例如先天免疫激動劑）來增強抗腫瘤免疫反應。靶向T細胞免疫檢查點（包括PD-(L)1、CTLA-4和LAG-3）的治療性單克隆抗體已經徹底改變了癌癥治療，在一部分患者中觀察到了有意義且持久的反應。此外，多種先天免疫激動劑——包括靶向TLR7/8、TLR9和STING通路的藥物——已被探索，但臨床成功有限。目前只有兩種FDA批準的先天免疫激動劑，兩者均為局部給藥：用于治療膀胱癌的膀胱內給藥的卡介苗，以及用于治療基底細胞癌的局部應用TLR7激動劑咪喹莫特乳膏。其他先天免疫激動劑——包括小分子STING激動劑——無論全身或瘤內給藥，都顯示出有限的抗腫瘤活性，其中許多表現出腫瘤滯留性差、清除快和劑量限制性全身免疫激活。為了克服這些挑戰，人們對靶向方法越來越感興趣，目前有多款包含TLR7/8、TLR9或STING激動劑負載的ADC處于臨床前和臨床開發階段。

本研究旨在探討腫瘤靶向STING激動劑ADC的治療潛力。STING是一種先天免疫通路，在感知到來自外來病原體、應激細胞或腫瘤細胞的胞內DNA時，能促進I型IFN和促炎細胞因子的強大產生。STING信號傳導驅動強大的免疫反應，這需要精確調控，因為異常的STING信號傳導與自身炎癥性疾病相關，包括系統性紅斑狼瘡、Aicardi-Goutières綜合征和嬰兒期發病的STING相關血管病。此外，急性全身性STING激動在小鼠模型中會導致致命的細胞因子釋放綜合征（無菌性休克）。我們假設，靶向ADC方法可能通過改善暴露、在TME內集中藥物分布以及減少全身免疫激活，來克服小分子STING激動劑觀察到的局限性。此假設的關鍵是確定一種連接子-負載，既能減少全身免疫激活，又能在多種同基因模型中促進強效的STING依賴性抗腫瘤活性。

本文描述了一種新型STING激動劑連接子-負載[非可裂解連接子（ncSTING）]的發現和評估。采用此連接子-負載的腫瘤靶向ADC在多種臨床前小鼠腫瘤模型中引發強大的抗腫瘤活性。我們發現，雖然并非必需，但Fcγ受體（FcγR）結合會影響抗腫瘤活性，因為在部分腫瘤模型中，具有野生型（WT）抗體Fc區的ADC比具有FcγR結合突變型Fc的ADC驅動了更強的抗腫瘤活性。我們還證明，與系統性給予釋放的負載相比，ncSTING ADC在引發腫瘤消退的同時，減少了外周免疫激活。總之，這些數據為通過ADC靶向遞送強效STING激動劑負載（而非系統性給予STING激動劑）提供了治療學依據。

本研究使用的所有抗體均為人IgG1或小鼠IgG2a（mIgG2a）同種型。αCD228抗體是克隆hL49，αB7-H4抗體是克隆B7H41001，αIB6抗體是克隆h15H3或h2A2，αEphA2抗體是克隆h1C1。αCD71抗體克隆是cOKT9，在其重鏈可變區引入單個N19K取代以去除N-連接糖基化以改善表達。“非結合”指代沒有已知結合表位的hIgG1或mIgG2a mAb。圖1中所示的所有連接子-負載和釋放的負載均按補充方法中描述合成。ADC是通過天然二硫鍵部分還原，隨后與馬來酰亞胺連接子-負載進行偶聯制備，以生成平均藥物/抗體比（DAR）為4的產品。根據需要采用了兩種不同的方案（見補充表S1）。偶聯方法1：通過與亞化學計量的三（2-羧乙基）膦（TCEP）（通常為2.2當量）孵育，實現IgG1或mIgG2a抗體的部分還原，以平均暴露每個抗體4個硫醇用于連接子-負載偶聯。偶聯方法2：mIgG2a抗體經歷類似的部分還原過程，或完全還原后進行N-乙基馬來酰亞胺封端。通過與過量TCEP孵育實現完全還原，然后緩沖液交換至PBS（pH 7.4）和2 mmol/L EDTA中以去除過量TCEP，并暴露每個抗體10個硫醇。完全還原的抗體與平均6個N-乙基馬來酰亞胺分子偶聯，以平均留下每個抗體4個硫醇用于連接子-負載偶聯。偶聯后，ADC用硫醇樹脂或活性炭純化以去除過量連接子-負載，并緩沖液交換至PBS（pH 7.4）或類似的中性緩沖液。通過還原型聚合物反相色譜/質譜和天然尺寸排阻色譜/質譜對ADC進行表征以確認DAR，并通過尺寸排阻色譜確認高分子量物質<10%（代表性表征見補充方法）。

使用THP1-Dual細胞和THP1-Dual KI-mSTING細胞評估小分子和ADC的效力，這些細胞含有IRF-Lucia熒光素酶報告基因。細胞在含有指示濃度化合物或ADC的培養基中培養。在鋪板后24小時（小分子）或48小時（ADC）收集上清液用于報告基因檢測。為了測量Lucia報告信號，將10μL上清液與40μL QUANTI-Luc發光測定試劑在96孔板中混合，并在PerkinElmer EnVision酶標儀上讀數。

HT-1080和MDA-MB-468腫瘤細胞用Incucyte Cytolight紅色慢病毒轉染。活細胞殺傷實驗通過接種RFP+ HT-1080或RFP+ MDA-MB-468腫瘤細胞進行。第二天，將從健康供體分離的外周血單個核細胞（PBMC）加入每個孔，并用指示濃度的小分子或ADC處理培養物。使用Incucyte S3活細胞分析系統進行自動細胞成像，并使用Incucyte分析軟件進行分析。通過計算96至120小時時RFP+腫瘤細胞的匯合度相對于t=0時的百分比來量化腫瘤細胞殺傷。繪制小分子、ADC（按DAR調整的負載濃度）或未偶聯mAb（調整至與ADC濃度匹配）的摩爾濃度圖。

所有體內實驗均經Seagen機構動物護理和使用委員會批準。從不同供應商購買無特定病原體小鼠，并飼養在無特定病原體屏障設施中。將不同腫瘤細胞系植入小鼠皮下。一旦腫瘤體積達到100 mm³，將小鼠隨機分組，并通過靜脈內或腹腔內給予單次或三次每周劑量的非結合或靶向ADC。每周兩次測量腫瘤體積。將mAb或偶聯物的儲備濃度稀釋至所需濃度。小分子配制在含有40% PEG400的鹽水中。

通過基于Guo及其同事報告的臨床前數據報告最佳實踐的指標AUC（“AUC.3”）評估腫瘤生長，該指標反映了連續生長曲線下的面積并考慮了研究時間。為了確定治療是否引發了與對照組相比具有統計學意義的抗腫瘤活性，進行單向方差分析檢驗，然后進行Tukey事后多重比較檢驗，以比較每個治療組的AUC.3值。

使用MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Multiplex Assay和Luminex MAGPIX儀器系統評估小鼠血漿或血清中的細胞因子水平。

將同基因腫瘤細胞系在96孔板中培養過夜。將測試品的系列稀釋液制備在細胞系特異性培養基中，并與癌細胞系孵育96小時。使用CellTiter-Glo發光細胞活力測定法根據制造商的說明書測定細胞活力。使用PHERAstar FSX酶標儀測定發光。使用GraphPad Prism 10.4中的非線性四參數曲線擬合模型確定IC₅₀和活力百分比。

評估了一系列STING激動劑作為潛在ADC負載，包括環狀二核苷酸、單體和二聚體小分子。我們確定了先前發表的bis-benzimidazole amide dimers作為一種適合用作ADC負載的強效STING激動劑化學型。我們假設可以在這些STING激動劑二聚體負載的中心口袋內嵌入連接子，而對從抗體釋放后的STING結合影響最小。因此，我們開發了一種模塊化路線，以高效制備STING激動劑庫，并從此庫中選擇了STING激動劑化合物1（cSTING釋放負載）作為可行的起點，以制備三種連接子-負載。我們合成了通過纈氨酸-丙氨酸二肽連接的蛋白酶可裂解連接子（pep-cSTING）、通過葡萄糖醛酸糖連接的葡萄糖醛酸酶可裂解連接子（gluc-cSTING），以及通過馬來酰亞胺丙基連接的非可裂解連接子（ncSTING）。包含pep-cSTING和gluc-cSTING連接子-負載的ADC預期在ADC內化和連接子在溶酶體中裂解后釋放母體cSTING負載（化合物1）。或者，包含半胱氨酸偶聯的ncSTING連接子-負載的ADC在ADC被溶酶體分解代謝后，釋放出帶有來自抗體的半胱氨酸殘基的ncSTING連接子-負載（化合物2）。因此，為了能夠直接比較兩種釋放的負載物種，我們通過ncSTING與半胱氨酸的反應合成了釋放的負載，得到ncSTING釋放負載（化合物2）。我們通過測量野生型和STING缺陷型小鼠骨髓源性巨噬細胞的IP-10釋放，證實了cSTING和ncSTING釋放負載的活性都是STING依賴性的。

將pep-cSTING、gluc-cSTING和ncSTING連接子-負載偶聯到靶向廣泛表達的抗原CD71的hIgG1 mAb以及非結合對照mAb上，平均DAR為4。使用THP1-Dual細胞評估這些ADC和相應釋放負載的效力。所有三種腫瘤靶向ADC均引發了強效的IFN報告基因活性，其效力比非結合ADC高約15至60倍，表明ADC負載遞送是靶點介導的。重要的是，靶向ADC驅動的IFN報告基因活性比相應的釋放負載強約130至370倍，這表明ADC能更有效地將負載遞送到細胞質中以結合STING，相比之下小分子跨質膜的被動擴散效率較低。最后，我們確認了ncSTING ADC和相應的釋放負載對小鼠和人STING具有相當的效力。

接下來，評估了腫瘤抗原靶向STING ADC在體外引發免疫細胞介導的腫瘤細胞殺傷的能力。制備了靶向CD228的ADC，并在由表達CD228的、工程化表達RFP的HT-1080腫瘤細胞和PBMC組成的共培養實驗中進行測試。通過使用Incucyte活細胞成像系統量化RFP+細胞匯合度來監測腫瘤細胞殺傷。用STING ADC或相應的釋放負載處理共培養物導致了腫瘤細胞殺傷，這與處理的腫瘤細胞單一培養形成對比，表明腫瘤細胞殺傷是免疫介導的。強大的腫瘤細胞殺傷依賴于腫瘤抗原介導的遞送，因為CD228靶向的ncSTING ADC驅動的免疫細胞介導的腫瘤細胞殺傷效力比非結合ncSTING ADC或釋放負載對照強約100倍。與THP1報告基因實驗一致，CD228靶向的ncSTING、pep-cSTING和gluc-cSTING ADC均引發了可比的腫瘤細胞殺傷。

通過使用經慢病毒轉導工程化表達腫瘤抗原CD228的小鼠LL2 Lewis肺癌細胞系，在體內進一步評估了連接子設計對抗腫瘤活性的影響。用單次5 mg/kg劑量的CD228靶向ncSTING、pep-cSTING和gluc-cSTING ADC靜脈內治療CD228-LL2腫瘤荷瘤小鼠。與體外觀察到的相似腫瘤細胞殺傷形成對比，CD228靶向的ncSTING ADC導致了優于pep-cSTING和gluc-cSTING ADC的抗腫瘤活性。所有ADC均耐受良好，體重變化最小。CD228靶向的ncSTING ADC顯示出顯著的抗腫瘤活性，而非結合對照則沒有，這與體內抗腫瘤活性依賴于STING激動劑負載的靶向遞送一致。通過測量小鼠血漿中總抗人IgG水平（即偶聯和未偶聯抗體）評估ADC的藥代動力學特征表明，所有三種CD228靶向ADC在靜脈給藥后的前4天具有相當的暴露量，這表明抗腫瘤活性的差異并非由抗體暴露量的變化驅動。此外，我們發現ncSTING ADC在給藥后6小時驅動的IP-10略少，而在24小時驅動的IL-6和IP-10比cSTING ADC多約2至3倍。鑒于抗體暴露量沒有差異但系統藥效學效應存在差異，我們假設釋放負載的ncSTING（化合物2）與cSTING（化合物1）在吸收、分布、代謝和排泄（ADME）特征上的差異（例如，在免疫細胞中的滯留和/或清除）影響了STING信號傳導的幅度和動力學。此外，這提出了ncSTING ADC增強的抗腫瘤活性可能與更持久的藥效學/細胞因子反應相關的可能性，盡管需要進一步研究來證明因果關系。盡管未在體內評估非結合ADC連接子-負載的直接比較，但基于在單腫瘤模型中觀察到的腫瘤靶向ADC的抗腫瘤活性，我們優先選擇ncSTING連接子-負載用于進一步研究評估。

接下來，評估了腫瘤靶向ncSTING ADC在多種免疫活性同基因腫瘤模型（LL2、EMT6、Renca和CT26）和腫瘤抗原（EphA2、CD228、B7-H4和IB6）中引發抗腫瘤活性的能力。測試的同基因模型中，除了Renca細胞在最高測試劑量下顯示出適度的敏感性外，沒有一種表現出固有的STING敏感性。與CD228、B7-H4和IB6不同，腫瘤抗原EphA2在多種小鼠腫瘤細胞系中內源性表達，因此，在LL2模型中平行運行。用CD228靶向和EphA2靶向的ncSTING ADC治療CD228-LL2腫瘤荷瘤小鼠引發了強大的抗腫瘤活性。類似地，B7-H4靶向的ncSTING ADC在攜帶工程化表達鼠B7-H4的EMT6和Renca腫瘤的小鼠中引發了強大的抗腫瘤活性。IB6靶向的ncSTING ADC在攜帶工程化表達鼠IB6的CT26腫瘤的小鼠中表現出適度的抗腫瘤活性。有趣的是，非結合ncSTING ADC在不同模型中引發了可變的活性，在CD228-LL2模型中沒有顯著的抗腫瘤活性，而在B7-H4-EMT6、B7-H4-Renca和IB6-CT26腫瘤模型中具有適度的抗腫瘤活性。然而，腫瘤靶向ADC驅動的抗腫瘤活性強于非結合ADC，證明了靶向遞送至TME的優勢。總之，這表明腫瘤靶向ncSTING ADC在多種小鼠腫瘤模型中誘導強大的抗腫瘤效應，利用了多種腫瘤