肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因。非小細胞肺癌（NSCLC）約占肺癌病例的85%。對于無靶向驅動突變的晚期NSCLC患者，標準一線治療是細胞毒性化療聯合靶向PD-L1或PD-1的免疫檢查點抑制劑（ICI）。然而，僅有一小部分患者能被治愈，超過一半的患者在治療開始后1年內出現疾病進展。疾病進展的部分原因在于NSCLC細胞獲得了對ICI治療的抵抗性。已報道的機制包括腫瘤抗原耗竭、T細胞功能障礙、免疫抑制細胞數量增加以及腫瘤細胞內PD-L1表達的改變。

此外，癌細胞經歷上皮-間質轉化（EMT），獲得對淋巴細胞裂解的抵抗性。EMT誘導的細胞表達高水平的轉化生長因子-β（TGF-β），后者促進免疫抑制性腫瘤免疫微環境（TIME）的形成。近來，藥物耐受持久癌細胞（DTP）被認為是導致后續腫瘤再生長的一個原因，這些細胞在治療期間存活于腫瘤內，并表現出可逆的抵抗性。越來越多的證據表明，DTP細胞可以重編程多種細胞過程，包括表觀遺傳調控、轉錄、翻譯和代謝，以在治療壓力下維持生存。此外，近期研究還涉及胰島素樣生長因子-1受體信號傳導、組蛋白去甲基化酶和癌細胞EMT的參與。

纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）是一種由多種細胞產生的47 kDa糖蛋白，是纖溶系統的抑制劑。PAI-1也被報道參與全身性炎癥、動脈粥樣化以及肺和腎的纖維化。此外，腫瘤組織中高PAI-1表達已被確定為不僅是NSCLC，也是其他癌癥類型的不良預后因素，其參與腫瘤進展已有描述。先前研究報道，在肺癌細胞中，PAI-1通過EMT促進對化療的獲得性抵抗，而EMT是抗PD-1（aPD-1）抗體治療的抵抗機制之一。研究還報道，PAI-1與奧希替尼治療的EGFR突變NSCLC細胞中通過EMT出現的DTP有關。基于這些發現，PAI-1可能是影響aPD-1抗體治療耐受性的一個重要因素。

TM5614是一種PAI-1抑制劑，是基于人PAI-1晶體結構進行計算機模擬藥物發現，從1400多種新型衍生物中篩選出的小分子藥物。在健康個體中的I期試驗以及慢性粒細胞白血病和2019冠狀病毒病（COVID-19）的II期試驗已表明，口服TM5614具有良好的耐受性和安全性。近期一項II期研究也顯示了納武利尤單抗聯合TM5614治療在納武利尤單抗治療期間發生疾病進展的黑色素瘤患者中的療效和安全性。

基于這些發現，本研究旨在利用TM5614和小鼠肺癌模型，研究PAI-1是否參與aPD-1抗體治療的NSCLC細胞中DTP的出現。此外，還探討了將PAI-1作為克服這種耐受性的治療靶點的可能性，以及aPD-1抗體與TM5614聯合治療是否可成為NSCLC的新治療策略。

本研究使用了小鼠肺腺癌細胞系Lewis肺癌（LLC）、小鼠肺鱗狀細胞癌細胞系KLN205、人肺成纖維細胞系MRC-5和小鼠巨噬細胞系Raw264.7。細胞在補充了7.5%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養基中，于37°C、5% CO₂的加濕培養箱中培養。TM5614在體內實驗中用羧甲基纖維素鈉溶解，在體外實驗中用DMSO溶解。在體外實驗中，TM5614的給藥濃度為62.7 μmol/L。使用了IgG2a同種型對照抗體和aPD-1抗體。通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）、微陣列測試、單細胞RNA測序（scRNA-seq）、免疫組織化學（IHC）染色、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和增殖測定等方法進行了分子和細胞水平分析。建立了小鼠皮下腫瘤模型，當腫瘤大小達到約200 mm³時開始治療。TM5614（10 mg/kg）每天口服灌胃給藥。IgG2a同種型對照抗體或aPD-1抗體每3天腹腔注射一次，劑量為250 μg。還回顧性分析了接受手術的NSCLC患者的臨床樣本。所有結果以平均值±標準誤表示，使用曼-惠特尼U檢驗進行兩組比較，使用單因素方差分析（ANOVA）和圖基檢驗進行三組或以上比較。統計學顯著性設定為P< 0.05。

為了研究aPD-1抗體耐受持久細胞（aPD-1-TP）在aPD-1抗體治療早期腫瘤中的PAI-1表達水平，研究建立了使用LLC和KLN205細胞的皮下腫瘤模型，并給予aPD-1抗體或IgG2a同種型對照抗體。腫瘤生長在治療開始后第7天之前受到相對抑制，之后腫瘤開始更快生長。因此，將aPD-1抗體治療7天后仍存活于腫瘤內的癌細胞定義為aPD-1-TP。微陣列分析顯示，在LLC和KLN205腫瘤模型中，aPD-1治療組的TGF-β信號通路均上調。鑒于TGF-β已被報道可誘導PAI-1表達并促進癌細胞EMT，研究接下來聚焦于PAI-1和EMT相關基因的表達。

兩個模型的微陣列分析均表明，aPD-1組表現出PAI-1和間質標志物表達上調，上皮標志基因表達下調。 qRT-PCR也顯示，aPD-1抗體治療的LLC腫瘤中PAI-1 mRNA表達水平顯著高于對照腫瘤。腫瘤切片的IHC染色表明，aPD-1抗體治療的LLC腫瘤中PAI-1陽性區域顯著大于對照腫瘤。這些結果表明，aPD-1-TP中的PAI-1蛋白表達水平顯著高于對照細胞。此外，在KLN205細胞皮下腫瘤模型中，aPD-1抗體治療的腫瘤中PAI-1 mRNA表達水平也顯著高于對照腫瘤。腫瘤切片的IHC染色也顯示，aPD-1-TP中的PAI-1蛋白表達水平顯著高于對照細胞。這些結果表明，aPD-1-TP表達的PAI-1水平顯著高于對照細胞。

隨后，為了研究腫瘤大小是否與癌細胞中PAI-1表達相關，比較了治療開始后第7天收集的腫瘤（小腫瘤組）與腫瘤生長后較晚時間點收集的腫瘤（大腫瘤組）的PAI-1水平。qRT-PCR顯示，LLC腫瘤中PAI-1 mRNA表達水平在大腫瘤組顯著高于小腫瘤組。腫瘤切片IHC染色顯示，大腫瘤組的PAI-1陽性區域比例顯著大于小腫瘤組。在使用KLN205細胞的實驗中也觀察到了類似結果。這些發現表明，在aPD-1抗體治療期間，隨著腫瘤增大，癌細胞中的PAI-1表達有增加趨勢。

為了研究PAI-1高表達是否也發生在人NSCLC中，比較了接受與未接受aPD-1抗體治療的手術切除NSCLC標本中PAI-1表達的差異。盡管樣本量小且對潛在混雜因素的調整不足限制了分析，但IHC染色顯示，接受aPD-1抗體治療的NSCLC標本中PAI-1表達顯著高于對照組。

給予aPD-1抗體暫時抑制了LLC細胞皮下腫瘤的生長，但大約在第30天觀察到了腫瘤再生長。研究隨后檢驗了抑制在aPD-1-TP中高表達的PAI-1是否能抑制后續的腫瘤再生長。研究了TM5614（一種已知可促進PAI-1蛋白降解的小分子PAI-1抑制劑）的治療潛力。TM5614在之前的tPA依賴性水解測定中的IC₅₀值<6.95 μmol/L。結果顯示，TM5614組上清液中的PAI-1蛋白水平顯著低于對照組。關于TM5614聯合aPD-1療法的體內抗腫瘤療效，在aPD-1抗體+TM5614組未觀察到腫瘤再生長。在KLN205細胞皮下腫瘤中也觀察到了類似結果。

鑒于TM5614的作用是通過PAI-1降解實現的，接下來檢驗了TM5614治療是否降低了腫瘤內的PAI-1表達。IHC分析顯示，TM5614治療組腫瘤組織中的PAI-1表達降低。隨后，研究了TM5614對肺癌細胞系體外的抗增殖作用。TM5614在LLC和KLN205模型中均顯著抑制了腫瘤細胞增殖�？傊�，這些發現表明，TM5614降低了腫瘤內的PAI-1水平，并對癌細胞增殖產生抑制作用。此外，PAI-1參與了aPD-1治療期間aPD-1-TP的存活及后續的腫瘤再生長。

為了排除TM5614對PAI-1以外的分子產生脫靶效應的可能性，使用另一種PAI-1抑制劑SK-216進行了額外的實驗。結果表明，與使用TM5614的實驗結果相似。特別是，與aPD-1單藥治療相比，aPD-1聯合SK-216治療在LLC和KLN205模型中均表現出顯著更好的抗腫瘤療效。這些發現表明，PAI-1有助于aPD-1-TP的存活。重要的是，TM5614抑制PAI-1顯著增強了aPD-1單藥治療的療效，且TM5614的活性對PAI-1具有特異性。

微陣列結果顯示，aPD-1抗體組間質基因表達更高，上皮基因表達低于對照組。這些發現表明aPD-1-TP通過誘導EMT而持續存在。qRT-PCR也顯示，與對照組相比，aPD-1抗體組的上皮基因表達顯著降低，間質基因表達顯著升高。相反，aPD-1抗體+TM5614組的間質基因表達顯著低于aPD-1抗體組。在KLN205細胞的腫瘤中也觀察到了類似結果。這些發現支持PAI-1參與了aPD-1治療期間aPD-1-TP的EMT，且TM5614抑制了aPD-1抗體治療的NSCLC細胞的EMT。

為了研究TM5614是否在較晚時間點抑制EMT，比較了第36天aPD-1抗體組與aPD-1抗體+TM5614組之間EMT相關基因的表達。aPD-1抗體+TM5614組的間質基因表達顯著低于aPD-1抗體組。在使用KLN205細胞的小鼠肺癌模型中也觀察到了類似結果。這些發現表明，TM5614在較