《Talanta》：Stage-aware quantification of the SARS-CoV-2 3CLpro biomarker via CsPbBr
3@COF-LZU1@AuNP electrochemiluminescence and Cas13a amplification
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該研究開發了一種基于水穩定CsPbBr3@COF-LZU1發射體的電化學發光（ECL）生物傳感器，集成肽-DNA構象開關與CRISPR/Cas13a擴增技術，實現SARS-CoV-2主蛋白酶（3CLpro）活性的高靈敏度“turn-on”檢測，檢測限達4.31 aM，并成功應用于臨床咽拭子樣本的分期診斷。
余電波|任浩珍|何鵬遠|李文波|唐前麗|黃龍健|魏繼華|張凱|廖先久
廣西民族醫科大學附屬醫院骨與關節退行性疾病臨床前與轉化研究重點實驗室，中國廣西百色，533000
摘要
在復雜基質中，直接基于活性的SARS-CoV-2主要蛋白酶（3CLpro）定量仍然具有挑戰性。本文報道了一種水兼容的電化學發光（ECL）生物傳感器，該傳感器結合了CsPbBr3@COF-LZU1發射體、肽-DNA構象開關以及CRISPR/Cas13a輔助擴增技術，將蛋白酶活性轉化為穩健的光學“開啟”信號。共價有機框架在水性介質中物理穩定了鈣鈦礦納米晶體，并與稀疏的金納米粒子層一起，支持鐵烯終止報告分子的組裝，通過近場/氧化還原淬滅作用實現超低基線。目標特異性切割釋放出一個啟動子，驅動熵介導的T7啟動子形成和轉錄，產生激活Cas13a的RNA；去除或遠離發射體的鐵烯可恢復光子輸出。在優化條件下，該傳感器在10至108 aM范圍內表現出寬的對數線性響應，檢測限低至4.31 aM，對常見干擾物具有高分析選擇性，制造精度高（電極間RSD約為3%），并且具有實用的穩健性（在4°C下12小時后信號保留率約為97%，7天后約為90%，120次ECL循環后約為92%）。逐步ECL、循環伏安法和阻抗分析證實了逐層組裝以及鐵烯介導的淬滅和Cas13a驅動的恢復機制。該平臺直接應用于經過最小處理的咽拭子提取物，能夠分辨不同疾病階段的群體差異，并捕捉到晚期樣本中3CLpro活性的預期衰減，支持在實際臨床樣本中進行階段感知的定量分析。這種模塊化設計——可在蛋白酶可切割基序、啟動子模板和crRNA處重新編程——為敏感、選擇性和水穩定的ECL酶活性檢測提供了一條通用途徑。
引言
基于活性的生物傳感器能夠報告酶功能而不僅僅是分析物的濃度，因此在早期診斷和藥物篩選中越來越受到重視。在病毒蛋白酶中，冠狀病毒的主要蛋白酶（3CLpro，也稱為Mpro）是一個經過驗證的治療靶點，其催化活性與病毒復制相關[1]。因此，能夠在復雜基質中快速、靈敏且選擇性地檢測3CLpro活性，將有助于及時評估感染或蛋白酶抑制情況，而無需依賴抗體的可用性或完整的病毒基因組。然而，傳統的熒光檢測方法受到光學背景、光漂白和笨重儀器的限制，而電化學方法則可能受到基質干擾和有限轉導增益的挑戰[2]；[3]。
電化學發光（ECL）通過偏置電極上的電化學反應產生光子，從而消除了外部激發光并最小化了自熒光[[4], [5], [6], [7]]。金屬鹵化物鈣鈦礦，特別是CsPbBr3納米晶體，是一種有前景的ECL發射體，因為它們具有高效的輻射復合、接近520 nm的窄發射峰和易于調節的表面[8]。然而，它們在水性電解質中的不穩定性以及與生物功能層直接接口時的電荷注入效率低下是其在分析應用中的主要障礙。將CsPbBr3限制在結晶共價有機框架（COFs）內提供了一種結構解決方案：剛性的多孔COF-LZU1支架在空間上穩定了鈣鈦礦，并為離子和電子創建了滲透路徑，實現了穩健且水兼容的ECL，同時保持了高發射效率[[9], [10], [11]]。因此，該平臺非常適合在同一電極上進行生物識別和信號處理化學反應。
為了將分子識別轉化為大的光學響應，我們將鈣鈦礦發射體與距離和氧化還原控制的淬滅劑耦合在金納米界面處。具體來說，玻璃碳電極（GCE）涂覆了一層薄的CsPbBr3@COF-LZU1，并覆蓋了一層稀疏的金納米粒子（AuNPs）。AuNPs作為硫醇化DNA報告分子的錨定點，這些報告分子的末端是鐵烯（Fc），這是一種眾所周知的ECL淬滅劑和電子介質。在完整狀態下，Fc與鈣鈦礦層之間的緊密接近通過近場能量轉移（ECL-RET）和/或競爭性氧化還原途徑抑制了光輸出，從而建立了低基線。切割或分離Fc標記的報告分子與界面后，ECL被恢復，產生敏感的“開啟”信號。
目標識別和生化擴增是通過整合一個構象鎖定的肽-DNA納米結構與CRISPR/Cas13a來協調的。肽結構包含一個可被3CLpro切割的基序，并在肽-DNA雜交體（CLIP）中機械鎖定一個啟動子DNA鏈。在沒有蛋白酶的情況下，啟動子被隔離，下游反應被動力學阻斷。當暴露于活性3CLpro時，肽切割釋放啟動子單鏈DNA[12]。這個啟動子觸發一個熵驅動的鏈交換電路，無需酶即可組裝出功能性的T7啟動子，隨后由T7 RNA聚合酶進行等溫轉錄，生成大量的RNA轉錄本[[13], [14], [15]]。這些轉錄本通過預設計的CRISPR RNA（crRNA）的序列特異性識別激活CRISPR/Cas13a（規律間隔短回文重復序列相關核酸酶）。激活的Cas13a表現出強大的旁路核糖核酸酶活性，無差別地切割附近的含尿苷核酸[5]。
我們通過在每個表面連接的DNA報告分子（5′-HS–DNA–rU–rU–Spacer–Fc-3′）中編碼兩個核糖尿苷（rU）來利用這種旁路活性。當Cas13a反應混合物接觸電極時，激活的核酸酶切割rU位點，切斷Fc標記的片段或將它們從鈣鈦礦界面移開。由此增加的發射體-淬滅劑距離和去除競爭性電子匯點共同在基于過硫酸鹽（S2O82?）的陰極工作模式下放大了ECL強度。由于每個上游生化步驟——蛋白酶切割、熵驅動的組裝、T7轉錄和Cas13a激活——都放大了信號，因此低水平的3CLpro活性被轉化為易于測量的光學輸出，且具有高特異性。
在這里，我們提出了一種鈣鈦礦-生物大分子雜化ECL生物傳感器，它整合了（i）一種水穩定的CsPbBr3@COF-LZU1發射體，用于高效、低背景的光子生成；（ii）一種由AuNP支持的Fc標記DNA報告分子，將分子事件轉化為距離和氧化還原控制的ECL調制；以及（iii）一種與熵驅動/T7/Cas13a擴增耦合的肽-DNA構象鎖，用于基于活性的3CLpro識別。所提出的架構在穩健的GCE基底上運行，使用容易獲得的試劑，并在蛋白酶底物和crRNA序列上提供了模塊化，使其能夠適應其他蛋白酶或核酸靶點。我們證明了這種設計在復雜樣品中具有寬動態范圍、低檢測限和強選擇性，突顯了其在快速蛋白酶篩選、抗病毒藥物評估和即時診斷方面的潛力。
部分摘錄
化學品和試劑
溴化銫（CsBr）、溴化鉛（PbBr2）、K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6）、KCl、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙醇、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，10 mM，pH 7.4）、三（2-羧乙基）膦（TCEP）、6-巰基-1-己醇（MCH）和牛血清白蛋白（BSA）均為分析級。氯金酸（HAuCl4·3H2O）、T7 RNA聚合酶和rNTPs、Cas13a及其緩沖液和crRNA、重組3CLpro以及GC376均從商業供應商處獲得。整個實驗過程中使用了超純水（18.2 MΩ cm）。所提出的ECL生物傳感器原理
所提出的生物傳感器通過整合一種水穩定的鈣鈦礦發射體、對蛋白水解響應的肽-DNA啟動子以及CRISPR/Cas輔助的核酸擴增級聯反應，將3CLpro的酶活性轉化為“開啟”的電化學發光（ECL）響應。
如圖1A所示，傳感平臺由限制在結晶共價有機框架（COF）內的CsPbBr3納米晶體構成。這種CsPbBr3@COF-LZU1雜化結構改善了界面
結論
我們開發了一種水兼容的、基于活性的ECL生物傳感平臺，它將CsPbBr3@COF-LZU1發射體與肽-DNA構象開關和CRISPR/Cas13a擴增相結合，將3CLpro活性轉化為穩健的“開啟”光學讀數。COF支架在水性介質中物理穩定了鈣鈦礦納米晶體，并與稀疏的金納米粒子層一起，提供了一個導電且生物正交的界面，用于組裝Fc終止的核酸報告分子，從而實現
CRediT作者貢獻聲明
余電波：寫作 – 審稿與編輯，寫作 – 原始草稿，監督，項目管理，方法學，研究，正式分析，數據管理，概念化。任浩珍：軟件，資源，方法學，研究，正式分析，數據管理，概念化。何鵬遠：驗證，監督，軟件，項目管理，資金獲取，正式分析，數據管理。李文波：監督，資源，項目管理，研究，資金
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的競爭性財務利益或個人關系可能會影響本文報告的工作。
致謝
我們衷心感謝廣西自然科學基金（2025GXNSFHA069115）、廣西骨與關節退行性疾病基礎與轉化研究重點實驗室（2022-06-20-2205）、百色生物分析化學與臨床分子診斷重點實驗室（2022-05-22）、百色生物分析化學應用與臨床分子診斷工程研究中心（2021-22-09）的財政支持。
