研究首先探究了造血干細胞和祖細胞（HSPC）的個體發育階段對NUP98::NSD1驅動的白血病轉化起始的影響。研究者比較了來自人類胎兒肝臟（FL）、臍帶血（CB）、以及兒科和成人骨髓（BM）的HSPC。通過CRISPR/Cas9介導的基因組編輯，在染色體11的NUP98和染色體5的NSD1自然斷裂點處誘導染色體易位，在各個發育階段的CD34⁺HSPC中產生框內NUP98::NSD1融合。結果發現，NUP98::NSD1陽性的FL來源HSPC克隆表現出強烈的選擇性優勢，在第四周時，NUP98::NSD1和NUP98::NSD1/WT1ko（WT1敲除）組中陽性克隆比例分別增至57%和89%。CB來源的HSPC也顯示出類似的陽性選擇趨勢，但富集程度較低。相比之下，來自兒科和成人BM的NUP98::NSD1陽性克隆則沒有顯示出陽性選擇的證據。單細胞染色質可及性基因分型（GoT-ChA）分析顯示，在體外培養四周后，FL和CB來源的、經過NUP98::NSD1/WT1ko編輯的HSPC中，融合陽性細胞在最原始的巨核-紅系祖細胞（MEP）簇中擴增。轉錄因子（TF）基序富集分析表明，FL和CB編輯的HSPC顯示出基本不同的TF富集模式，提示融合蛋白以發育階段特異性的方式驅動不同的表達程序來啟動白血病。

接下來，研究在體內部署了CRISPR/Cas9工程化的、處于不同發育階段的HSPC，建立了人源化異種移植小鼠模型。結果顯示，表達NUP98::NSD1的FL細胞表現出顯著增強的自我更新能力。與對照FL異種移植物相比，NUP98::NSD1和NUP98::NSD1/WT1ko FL異種移植物的白血病起始細胞頻率高出50倍以上。重要的是，次級FL NUP98::NSD1/WT1ko異種移植小鼠含有顯著更高比例的CD34⁺CD117⁺干細胞和祖細胞，以及相對增加的CD19⁺淋巴樣細胞，表明WT1缺失增強了干性并改變了譜系層級。

當使用CB和成人BM來源的HSPC進行實驗時，發現NUP98::NSD1需要WT1功能缺失這樣的合作突變才能在CB細胞中誘導白血病發生，而NUP98::NSD1單獨似乎足以在FL來源的HSPC中啟動AML。NUP98::NSD1編輯的BM來源HSPC則完全無法產生融合陽性的原發性異種移植物，表明即使有WT1功能缺失，也無法轉化BM來源的HSPC。這些結果強調了NUP98::NSD1驅動的AML的發育特異性，其轉化能力僅限于胎兒和早期出生后窗口期，并隨HSPC年齡增長而逐漸喪失。

研究通過單細胞RNA測序（scRNA-seq）和單細胞染色質可及性測序（scATAC-seq）深入解析了白血病干細胞（LSC）的分子特征。分析發現，與對照組和WT1ko組異種移植物主要包含淋巴樣細胞不同，NUP98::NSD1和NUP98::NSD1/WT1ko FL異種移植物顯著富集了HSPC和髓系譜系細胞https://aacr.silverchair-cdn.com/aacr/content_public/journal/cancerdiscovery/16/3/10.1158_2159-8290.cd-25-0556/2/m_cd-25-0556_f3.png?Expires=1775464454&Signature=icFfMWdK9YPnCNTGK7NkirOtROlomRG-0R3Zy8eIQYgrEkCH1jylagKg~Otk9ZbgmI7Z2eb2Gq860ZWDM0cFwts1fQ5isQWjKuI4F4ooiUaLnBEwOR6BB3yFcwpPdbTz8mP3jzW6gpIKfahXER5Cw3Eeeb4wUMNSP5WK-j5ouDfon7zahdeZHrce2JydJ9CVU9stBR87RJ7rFnVSbw0PIKBb6y6HhdOKmq9vKWI1oSkqXk~t~x-135gSCky5cneSlvCHe8iTLNHlRcG9dN103JBRlWDo3hxgA~ehfaFzdNPrBsp56Qae9XwxXwH6QTEGO63oGhcJiX4s-xhR~TfRZw&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA" caption="">