《Poultry Science》：Effects of short fasting periods and recovery diet protein level on molting response and postmolt productivity in aged laying hens
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柑橘采后病害中潛伏感染真菌群落動態及致病機制研究表明，預采收階段真菌α多樣性較高，β多樣性變化顯著，儲存后核心微生物減少，Alternaria、Fusarium和Colletotrichum等病原菌豐度增加引發主要病害，同時有益微生物下降。研究通過ITS測序揭示采前至采后微生物網絡穩定性差異，為潛伏感染病害防控提供新思路。
陳江華|徐夢婷|朱婷|楊子怡|劉娟|段杰|林陽|余曉|江道宏|傅艷萍
湖北省植物病理學重點實驗室，華中農業大學，武漢430070，中國
摘要
除了與傷口相關的感染（如綠霉病、藍霉病和酸腐病）之外，潛伏性感染是柑橘類水果（Citrus unshiu）最常見的采后病害類型。這些病害特別難以控制，其潛在的致病機制也尚未得到充分研究。在本研究中，我們使用ITS測序技術監測了從采前發育到儲存期間柑橘果實中微生物群落的動態變化。β多樣性分析顯示真菌群落組成發生了顯著變化。值得注意的是，在采前發育階段觀察到了更大的變異性，而采后樣本的變異性相對較小。微生物相互作用網絡和LEfSe分析進一步表明，采前樣本中的微生物網絡更為穩定。此外，與采前階段相比，儲存期間核心微生物的數量明顯減少。對采后病害的調查發現，由Alternaria、Fusarium和Colletotrichum屬真菌引起的腐爛病是主要病害，且病害發生率與Alternaria和Colletotrichum的數量呈正相關。同時，采后有益微生物的數量顯著下降。因此，有益微生物的減少以及潛在致病真菌的增加可能在柑橘果實采后病害的發生中起著重要作用。本研究為理解潛伏性感染的致病機制提供了理論基礎，并為控制這些病害提供了新的思路。
引言
潛伏性感染的特點是病原體在宿主體內長期存在而不引發明顯的疾病或大量復制。在這一潛伏階段，病原體保持休眠或靜止狀態，通常表現出最低的基因表達，以逃避宿主免疫系統的檢測和清除。許多采后病害的發生與潛伏性感染直接相關。典型的例子包括柑橘和芒果的莖端腐爛、香蕉的炭疽病（Hu等人，2012年；Deng和Ceng，2008年）、仁果類水果（蘋果和梨）的黑斑病和核霉病、核果類水果（桃子）的褐腐病、漿果（葡萄）的灰霉病、甜瓜的白霉病、辣椒的果實腐爛以及土豆的干腐病（Adaskaveg等人，2000年；Gell等人，2008年；Yin等人，2010年）。
研究表明，潛伏性感染性病原體在果實生長期間通過感染進入果實。潛伏性感染的一個典型特征是病原體在進入宿主后很長一段時間內保持不活躍狀態。只有在有利條件下才會變得活躍并引發癥狀，最終導致病害爆發（Prusky，1996年）。例如，Diplodia屬、Phomopsis mangiferae、Cytosphaera mangiferae和Pestalotiopsis屬真菌會定殖在芒果的花序組織中（Johnson等人，1992年）。花序和花梗組織的內源性定殖是果實成熟過程中導致莖端腐爛的主要機制（Johnson等人，1992年）。Nair和Parker（1985年）以及Pezet等人（2003年）的觀察表明，Botrytis cinerea會感染花器官和未成熟的果實，在壞死的花器官中保持半休眠狀態或在葡萄發育過程中保持休眠狀態。此外，B. cinerea主要存在于新鮮食用的葡萄的果柄中，而在葉片或果實表面的存在量相對較低（Holz等人，2003年）。同時，Alternaria可以直接穿透杏子和芒果的角質層或氣孔，從而在果實中潛伏（Larsen等人，1980年；Prusky，1983年）。類似地，Colletotrichum gloeosporioides會在成熟的藍莓上形成附著物，然后進入潛伏期（Hartung，1981年）。
柑橘果實腐爛是采后運輸和儲存期間常見的病害，嚴重威脅著中國乃至全球的柑橘產業。通常，腐爛率為20–30%，有時甚至高達50%，造成嚴重的采后經濟損失（Salunkhe等人，1991年）。在柑橘類水果中，潛伏性感染病害是最普遍的采后問題，包括炭疽病（Colletotrichum屬）、Diplodia莖端腐爛（Lasiodiplodia theobromae）、Diaporthe莖端腐爛（Diaporthe屬）和Alternaria莖端腐爛（Alternaria citri）。這些病害每年導致了相當大的采后損失。
盡管已有大量研究關注果實上的病原體潛伏性感染，但關于潛伏性感染在宿主植物中引起的病害機制的研究仍然有限。這一空白不利于采后病害的科學控制。為了研究潛伏性感染引起的采后病害的機制，我們采用了高通量測序技術來分析柑橘果實在不同生長階段的真菌群落組成變化，旨在探討真菌對由潛伏性感染引起的柑橘果實采后病害的影響。
樣本收集和DNA提取
2021年，我們從華中農業大學的一個果園收集了 Satsuma 柑橘（Citrus unshiu）的花朵和果實樣本，采集時間包括：萌芽期（BP）、開花期（FP）、開花后30天（30DAF）、開花后150天（150DAF）、采后立即（0WAH）以及采后3周、6周和9周（3WAH、6WAH和9WAH）（圖S1）。采后的果實被單獨包裝并儲存在15°C以下。同時監測了病害發生情況。
真菌群落的α多樣性和β多樣性分析
使用Pielou均勻度指數、Shannon多樣性指數和觀察到的物種豐富度進行α多樣性分析后發現，萌芽期（BP）、開花后150天（150DAF）以及所有采后樣本的多樣性、均勻度和豐富度均顯著低于開花期（FP）和開花后30天（30DAF）的樣本（p < 0.05）。然而，不同采后時間點之間沒有顯著差異（圖1A-C）。
使用主坐標分析進行β多樣性分析
討論
柑橘的采后病害（不包括傷口感染）被歸類為潛伏性感染；然而，這些感染的致病機制很少被報道。在本研究中，我們對采前和采后期間收集的柑橘果實樣本進行了ITS測序，并進一步研究了采后病害以進行分析。研究結果表明，在不同生長階段，柑橘果實中積累了不同的真菌。
結論
結論表明，柑橘果實的采前發育階段具有更高的微生物多樣性和更復雜、穩定的微生物網絡。相比之下，采后的柑橘果實顯示出較低的微生物變異性、脆弱的網絡結構以及核心微生物數量的顯著減少。此外，由Alternaria、Fusarium和Colletotrichum屬真菌引起的果實腐爛是儲存期間主要的采后病害。
作者聲明
研究的構思與設計：陳江華和傅艷萍。數據獲取、分析和解釋：陳江華、徐夢婷、朱婷、楊子怡、劉娟、段杰。文章起草：陳江華和傅艷萍。重要內容的批判性修訂：林陽、余曉和江道宏。最終版本審批：傅艷萍。
作者貢獻聲明
楊陽：驗證、軟件、方法學。 段杰：驗證、調查。 劉娟：調查。 傅艷萍：寫作——審稿與編輯、初稿撰寫、監督、資源管理、項目協調、資金籌集、概念構思。 江道宏：寫作——審稿與編輯、可視化、驗證、方法學、數據管理。 余曉：驗證、方法學、數據管理。 楊子怡：調查。 朱婷：調查。 徐夢婷：調查。 陳江華：利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文的研究工作。
致謝和資助
本工作得到了國家研發計劃（2021YFD1600102）和CARS-26專項資金的支持。
