《Polymer》：Effect of source and reaction conditions on the structure and rheological properties of gelatin methacryloyl
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GelMA的合成方法與明膠來源對結(jié)構(gòu)及流變學(xué)性質(zhì)的影響研究，系統(tǒng)比較了豬、牛、魚三種明膠經(jīng)雙相與單相法（DMSO溶劑）合成的甲丙烯酰化程度、二級結(jié)構(gòu)及熱響應(yīng)凝膠行為，發(fā)現(xiàn)單相法能更精確調(diào)控取代度但可能干擾鏈間作用，優(yōu)化后GelMA適用于3D生物打印和組織工程。
Laura Di Muzio | Flavia Borrelli | Claudia Pigliacelli | Simone Manetto | Alessia Ciogli | Giulia Mazzoccanti | Mattia Spano | Barbara Bigi | Maria Antonietta Casadei | Stefania Petralito | Patrizia Paolicelli
羅馬智慧大學(xué)藥物化學(xué)與技術(shù)系，意大利羅馬 00185
摘要
本研究的目的是系統(tǒng)地探討明膠的來源和合成方法如何影響甲基丙烯酰化明膠（GelMA）的結(jié)構(gòu)和流變性能。盡管GelMA在生物醫(yī)學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用，但關(guān)于明膠來源和合成方法對GelMA影響的直接和比較分析仍然有限，尤其是在傳統(tǒng)雙相合成方法與新型單相合成方法之間的差異方面。為填補(bǔ)這一空白，本研究使用豬明膠、牛明膠和魚明膠，分別采用傳統(tǒng)的雙相合成方法和在極性非質(zhì)子溶劑DMSO中進(jìn)行的均相合成方法制備了GelMA。對所得聚合物進(jìn)行了廣泛的表征，包括衍生化程度（DD）、二級結(jié)構(gòu)以及熱響應(yīng)性凝膠化行為等方面的研究。研究結(jié)果表明，明膠的來源和合成方法對GelMA的性能具有顯著影響。雖然單相合成方法能夠更好地控制衍生化程度，但同時也改變了聚合物的流變行為，這可能是由于鏈間相互作用受到破壞所致。通過闡明這些關(guān)系，本研究為選擇合適的明膠來源并根據(jù)最終生物材料的性能要求定制合成策略提供了理論依據(jù)。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)有助于優(yōu)化GelMA在多種制藥和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的性能，包括3D生物打印和組織工程。
引言
明膠（Gel）是組織工程和再生醫(yī)學(xué)中最常用的生物聚合物之一，尤其是其甲基丙烯酰化衍生物（GelMA）[[1], [2], [3]]。通過將明膠與甲基丙烯酰基團(tuán)進(jìn)行功能化，可以克服傳統(tǒng)明膠基支架的不足，如機(jī)械性能較差、在生理溫度下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定以及在組織培養(yǎng)過程中容易快速溶解等問題。2000年，Van Den Bulcke等人首次報道了利用甲基丙烯酸酐（MAA）合成GelMA的方法[[4]]。值得注意的是，盡管經(jīng)過二十多年的研究，GelMA的基本合成方法幾乎沒有變化，文獻(xiàn)中僅報道了少量的反應(yīng)條件調(diào)整[[5]]。通常，首先將明膠溶解在水性緩沖液中（最常用的是磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液），以創(chuàng)造可控的反應(yīng)環(huán)境，然后加入甲基丙烯酸酐作為功能化試劑。為了促進(jìn)反應(yīng)，混合物通常需要在高于聚合物凝膠化溫度（Tgel）的溫度下加熱。雖然這種合成方法被廣泛采用并且可以實現(xiàn)明膠的功能化，但它對衍生化程度和GelMA的物理化學(xué)性質(zhì)的控制能力有限[[6]]。這種缺乏可調(diào)性的問題對于某些應(yīng)用來說是一個重大限制，因為在這些應(yīng)用中需要精確且可重復(fù)地控制材料性能，例如增材制造和組織工程的支架制備以及三維細(xì)胞培養(yǎng)[[5],[7],[8],[9],[10]]。這種限制主要源于甲基丙烯酸酐的水溶性較差，迫使反應(yīng)在雙相體系中進(jìn)行（即兩相合成），其中明膠位于水相，而甲基丙烯酸酐形成獨(dú)立的有機(jī)相，從而影響了聚合物反應(yīng)基團(tuán)的可用性。為了克服這一限制，Di Muzio等人最近提出了一種單相合成方案[[11]]，在該方案中，明膠和甲基丙烯酸酐均完全溶解在有機(jī)溶劑二甲基亞砜（DMSO）中，消除了合成過程中的相異性。這種方法能夠更好地控制明膠的衍生化程度，同時減少了傳統(tǒng)雙相合成所需的甲基丙烯酸酐用量。除了對反應(yīng)效率的影響外，DMSO的使用還顯著改變了GelMA的物理化學(xué)性質(zhì)，尤其是其流變響應(yīng)。典型的熱溶-凝膠轉(zhuǎn)變過程發(fā)生了顯著變化，凝膠化溫度（Tgel）發(fā)生了明顯變化，使得材料在室溫下仍能保持低粘度液態(tài)，從而便于操作。這一特性在那些需要GelMA在室溫下具有類似固體行為或高粘度的應(yīng)用中特別有利，例如高分辨率生物打印技術(shù)（如立體光刻（SLA）和數(shù)字光處理（DLP）生物打印[[12],[13],[14],[15]]。
盡管取得了顯著進(jìn)展，但不同來源的GelMA以及采用不同合成方法（雙相 vs. 單相）制備的GelMA之間的系統(tǒng)比較仍然有限。迄今為止的大多數(shù)比較研究僅集中在傳統(tǒng)雙相方法的變體上。為填補(bǔ)這一空白，本研究系統(tǒng)地探討了明膠來源和合成策略（雙相 vs. 單相）對GelMA性能的綜合影響。具體而言，本研究首次直接比較了使用傳統(tǒng)雙相方法和新型單相方法從豬明膠、牛明膠及冷水魚明膠制備的GelMA衍生物。評估了明膠來源和合成方法對GelMA流變性能和機(jī)械性能的影響，并將其與氨基酸組成和二級結(jié)構(gòu)的差異進(jìn)行了關(guān)聯(lián)。通過系統(tǒng)地比較這些變量，本研究旨在為GelMA的合成提供理論指導(dǎo)，從而精細(xì)調(diào)整聚合物性能，以滿足特定的生物醫(yī)學(xué)和制藥應(yīng)用要求。
材料
材料
所有使用的試劑均為分析級。豬皮來源的A型明膠（P-Gel，約300 Bloom單位）、牛皮來源的B型明膠（B-Gel，約225 Bloom單位）以及冷水魚皮來源的魚明膠（F-Gel）、無水二甲基亞砜（DMSO）、氘代水（D2O）、甲基丙烯酸酐（MAA）、2-羥基乙基甲基丙烯酸酯（HEMA）、煙酰胺（Nic）、過硫酸銨（APS）、N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）和截留分子量為12-14 kDa的透析膜均購自Sigma公司。
反應(yīng)條件對GelMA衍生化程度的影響
首先分析了來自不同來源的明膠（豬皮來源的P-Gel、牛皮來源的B-Gel和魚皮來源的F-Gel）的氨基酸組成。經(jīng)過dabsyl衍生化處理后，所有明膠樣品中均檢測到了18種氨基酸（見圖S1和表S1）。各來源的相對氨基酸組成如圖1所示。
值得注意的是，His和Lys在色譜圖中呈現(xiàn)多個峰，這是因為它們能夠與dabsyl發(fā)生多次衍生化反應(yīng)。
結(jié)論
用于明膠甲基丙烯酰化的反應(yīng)條件顯著影響了甲基丙烯酰化程度的重現(xiàn)性和GelMA的流變性能。在DMSO中的均相合成方法能夠更好地控制甲基丙烯酰化程度，并有助于獲得具有更高取代水平的生物相容性衍生物。此外，這種方法還減少了甲基丙烯酸酐的消耗并提高了聚合物的合成效率。
CRediT作者貢獻(xiàn)聲明
Laura Di Muzio：撰寫 – 審稿與編輯、數(shù)據(jù)可視化、方法學(xué)設(shè)計、實驗研究、數(shù)據(jù)分析、概念構(gòu)建。
Flavia Borrelli：實驗研究。
Claudia Pigliacelli：撰寫 – 審稿與編輯、初稿撰寫、方法學(xué)設(shè)計、實驗研究、數(shù)據(jù)分析。
Simone Manetto：撰寫 – 審稿與編輯、方法學(xué)設(shè)計、實驗研究、數(shù)據(jù)分析。
Alessia Ciogli：撰寫 – 審稿與編輯、初稿撰寫、方法學(xué)設(shè)計。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的財務(wù)利益沖突或個人關(guān)系可能影響本文的研究結(jié)果。
致謝
作者感謝羅馬智慧大學(xué)提供的財政支持。
