肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球第六大常見癌癥，每年導致約60萬人死亡。HCC通常發生在肝硬化患者中，由長期肝臟炎癥和修復引起，病因主要包括慢性病毒性（主要是乙型和丙型肝炎病毒）感染或酒精性/非酒精性脂肪肝病。由于早期癥狀不明顯，大多數HCC患者在確診時已處于晚期，預后極差，中位生存期僅為1-2年，5年生存率低于16%。因此，HCC的早期檢測對于及時治療和降低高死亡率至關重要。

目前的指南建議對HCC高危人群每6個月進行一次超聲篩查，但其對早期肝癌的檢出率有限（靈敏度約51%，特異性91%）。作為血清標志物的甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP）用于HCC篩查的臨床價值仍存在爭議，因其靈敏度較低。盡管有許多非侵入性生物標志物被研究，但鮮有能在HCC中成為公認的診斷或治療靶點。因此，迫切需要新的、穩健的非侵入性方法來改善HCC的早期診斷。

DNA甲基化水平的改變是包括HCC在內的許多癌癥的主要特征之一。基因啟動子區域的超甲基化通常與基因沉默相關，且在CpG島（CpG island, CGI）中具有一致的修飾狀態。血漿循環游離DNA（cell-free DNA, cfDNA）的異常DNA甲基化檢測為癌癥篩查提供了一種新穎且有前景的策略。基于微陣列的全基因組甲基化研究已經開展，并構建了一些用于HCC檢測的診斷模型。然而，甲基化陣列僅覆蓋全基因組甲基化組的一小部分，而全基因組重亞硫酸鹽測序（whole-genome bisulfite sequencing, WGBS）具有無與倫比的優勢，其全面、無偏倚的性質使研究人員能夠描繪癌癥甲基化組的完整圖景。

本研究旨在通過整合WGBS與轉錄組學分析，識別HCC中異常高甲基化并伴隨基因表達顯著沉默的基因子集，進而篩選可用于HCC無創檢測的血液生物標志物，并評估其臨床性能。

本研究分為兩個階段。第一階段，利用WGBS和多個數據集中的基因表達譜篩選候選DNA甲基化標志物。第二階段，使用來自HCC患者和健康對照的獨立血漿樣本驗證所選標志物。研究流程概覽如圖1所示。

本分析使用的樣本來自四個隊列。33名HCC患者被招募為生物標志物發現隊列，其配對的HCC和癌旁正常肝組織用于本研究。72名無癌癥個體的外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）樣本也用于分析。此外，還從TCGA和NCBI GEO數據庫下載了八個公開的甲基化數據集。

用于驗證的血漿樣本來自樹蘭（杭州）醫院的48名HCC患者和24名健康對照者。所有外周血樣本均使用Cell-free DNA BCT管采集，并按照說明書分離血漿。本研究經浙江大學醫學院附屬第一醫院倫理委員會批準，所有參與者均根據機構指南簽署書面知情同意書。

為了探索可用于HCC無創診斷的甲基化標志物，研究者通過分析發現隊列組織樣本的WGBS DNA甲基化譜，識別了所有位于啟動子區域的差異甲基化區域（differentially methylated regions, DMR）。所得的beta（β）值用于識別腫瘤和非腫瘤樣本之間的DNA甲基化變化（Δβ）。同時，通過對發現隊列的mRNA-Seq數據進行差異表達分析，識別差異表達基因（differentially expressed genes, DEGs）。

通過確定pDMRs和DEGs的交集進行甲基化和表達的整合分析，以改善cfDNA甲基化標志物的可靠性。此外，為了分析pDMRs的順式調控效應，計算了pDMR甲基化水平（β）與匹配基因表達水平之間的斯皮爾曼相關系數。

研究者設定了嚴格的篩選標準來選擇目標DMRs：（1）腫瘤與癌旁組織間的甲基化差異大于0.3（高甲基化DMR，hyper-DMR）；（2）DMR位于啟動子區域（pDMR），且對應基因在腫瘤和癌旁組織間表達水平存在顯著差異；（3）DMR與對應DEG的斯皮爾曼相關系數小于-0.3。滿足這些標準的DMR被稱為目標高甲基化pDMR。

八個公開的甲基化數據譜使用R語言“wateRmelon”包中的betaqn函數進行獨立歸一化。為了驗證目標高甲基化pDMR的甲基化差異，使用公共數據集作為測試集，提取并比較位于目標高甲基化pDMR內的CpG位點在腫瘤和非腫瘤組織中的甲基化水平（β）。

此外，作為cfDNA DMR標志物的“背景甲基化”，PBMC DNA在候選區域的甲基化水平應處于低甲基化狀態，以確保這些標志物的特異性。同時，考慮到qMSP檢測cfDNA甲基化標志物的擴增片段長度限制（通常檢測<200 bp的cfDNA），研究者從八個目標高甲基化pDMRs中根據以下標準篩選標志物：（1）CpG位點位于150 bp窗口內；（2）單個窗口內有四個或更多CpG位點，以提高檢測的特異性和靈敏度；（3）每個CpG位點在腫瘤組織中持續表現出高甲基化（β > 0.6），而在癌旁組織和PBMC中持續低甲基化（β < 0.2）。

使用MagMAX cfDNA Isolation Kit從血漿樣本中分離cfDNA，并使用Qubit 3.0熒光計對純化的cfDNA進行定量。使用EZ DNA甲基化試劑盒對10 ng cfDNA進行重亞硫酸鹽處理。

采用qMSP檢測血漿cfDNA中甲基化的TSPYL5。為靶基因啟動子區域設計了特異性引物，并以ACTB基因作為重亞硫酸鹽轉化cfDNA輸入量的內參。PCR在ABI 7500DX儀器上進行。由于91.6%的健康對照參與者的C_T值無法通過實時PCR檢測到，本研究采用預先設定的C_T閾值（= 38）來判斷TSPYL5甲基化的陽性與否。當C_T值 ≤ 38時，判定測試樣本為陽性。

通過對發現隊列的WGBS數據分析發現，約34%的CpG位點在癌組織和癌旁組織之間存在顯著的甲基化水平差異。其中，157,320個位點呈高甲基化，9,710,380個位點呈低甲基化。高甲基化位點主要位于基因啟動子區域，而低甲基化位點主要位于基因體區域。共識別出608,279個DMRs，其中6,924個在HCC中高甲基化（hyper-DMR），601,355個低甲基化（hypo-DMR）。

對發現隊列的mRNA-Seq數據進行差異表達分析，結果顯示有11,672個基因的表達水平存在顯著差異。其中，6,912個基因高表達，4,760個基因低表達。

為了篩選對相應基因表達具有沉默功能效應（順式調控）的DMRs，研究者對高甲基化pDMRs（Δβ > 0.3）和DEGs進行了交集分析，隨后對同一基因的甲基化和表達進行了斯皮爾曼相關分析。結果顯示，在29個交集的高甲基化pDMRs中，有8個與相應基因的表達呈負相關，這些被稱為目標高甲基化pDMRs。

這八個目標高甲基化pDMRs對應的基因符號分別為TSPYL5、GNA14、LRRC4、CYP26A1、TACSTD2、FAM83F、TBX15和STEAP4。其中，TSPYL5的甲基化差異（Δβ）最大，為0.42，與基因表達的負相關性也最強（相關系數為-0.62）。

為了確認這八個目標高甲基化pDMRs的甲基化差異，研究者利用外部公共數據集分析了位于這些DMR內的CpG位點的甲基化差異。結果顯示，在獨立數據集中，腫瘤樣本可以與正常組織區分開來，表明了研究結果的穩健性。

八個目標高甲基化pDMRs的基因組組織情況如圖所示。研究表明，PBMC DNA在這些區域的甲基化水平較低。其中，chr8:97277329_97278175（匹配TSPYL5基因啟動子區）和chr9:77647531_77648367（匹配GNA14基因啟動子區）是兩個在腫瘤和正常組織間甲基化差異（Δβ）最大的DMR，分別達到0.416和0.400。腫瘤樣本中的β值穩定在0.6以上，而正常組織中的β值穩定在0.2以下。

研究者嘗試設計GNA14啟動子區的qMSP引物，但未能擴增出足夠的PCR產物；因此，選擇TSPYL5啟動子區域甲基化（meTSPYL5）作為進一步血漿cfDNA驗證的靶標。

在發現隊列中，TSPYL5甲基化水平在年齡、性別、腫瘤直徑、巴塞羅那臨床肝癌（Barcelona Clinic Liver Cancer, BCLC）分期、乙肝狀態和血清AFP狀態等臨床亞組間均未觀察到顯著差異。這些結果表明TSPYL5甲基化是一個獨立的診斷生物標志物。

泛癌分析顯示，TSPYL5在多種癌癥類型中甲基化水平升高，表明其可能缺乏癌癥類型特異性，但這并不影響其在監測HCC高危人群中的應用價值。

為了評估meTSPYL5 qMSP檢測在利用血漿cfDNA診斷HCC中的性能，研究者測試了72個有效樣本，包括48個HCC樣本和24個健康對照樣本。C_T值的受試者工作特征曲線下面積（Area Under ROC Curve, AUC）為0.921。在48名HCC患者中，血漿cfDNA的meTSPYL5 qMSP檢測總體靈敏度為85.4%（41/48）。與BCLC A期相比，更早期的BCLC 0期患者的C_T值更低，表明甲基化水平更高。在7名檢測結果為假陰性的HCC患者中，分別有3、2、1、1名患者處于BCLC 0、A、B、C期。這7名患者中，除1例無AFP檢測結果外，其余6例AFP結果均為陽性。這一結果提示，將AFP檢測與meTSPYL5甲基化檢測結合可以提高診斷靈敏度。24名無癌參與者的特異性為100%（24/24）。因此，meTSPYL5是HCC無創檢測的一個良好候選標志物。

在cfDNA驗證隊列中，44名接受血清AFP檢測的HCC患者中，僅有31人被檢測為陽性，靈敏度為70.5%。相比之下，meTSPYL5甲基化對HCC檢測具有更好的靈敏度。當AFP檢測與meTSPYL5甲基化檢測結合時，檢測靈敏度達到100%。在發現隊列中的相關性分析顯示，TSPYL5的甲基化水平與AFP的表達水平相關性非常弱（R = 0.28, p = 0.021），進一步證明了TSPYL5甲基化與AFP水平之間的相互獨立性。

HCC的表觀遺傳生物標志物已基于甲基化陣列進行了廣泛研究，但至今尚未有商業化產品。本研究首次利用WGBS數據結合轉錄組學分析，識別用于HCC診斷的生物標志物。整合WGBS和匹配的基因表達數據，識別出八個高甲基化啟動子區域，它們與基因表達呈顯著負相關。這八個高甲基化DMRs分別位于TSPYL5、GNA14、LRRC4、CYP26A1、TACSTD2、FAM83F、TBX15和STEAP4的啟動子區域。其中六個基因先前已被報道存在高甲基化伴隨表達沉默。CYP26A1和FAM83F的高甲基化是在HCC患者中的新發現。

這些基因的甲基化差異在外部獨立隊列中得到了確認。此外，這八個基因在PBMC中均為低甲基化，表明這些基因的甲基化在臨床實踐中具有作為無創診斷生物標志物的潛力。在這八個標志物中，TSPYL5和GNA14具有最大的Δβ和最強的表達負相關性。由于meGNA14在檢測方法開發階段擴增失敗，因此選擇meTSPYL5在血漿cfDNA中進行驗證。

值得注意的是，在85.4%的HCC血漿樣本中檢測到meTSPYL5，顯著高于HCC患者血清AFP的檢出率（70.5%）。這些數據表明，meTSPYL5是HCC患者潛在的有前景的早期預測生物標志物，鼓勵在更大規模隊列中進行進一步研究。本研究中DNA甲基化與表達的相關性系數對于TSPYL5為-0.62，表明TSPYL5甲基化具有很強的調控作用，并可能驅動癌癥發展。

本研究的最終目標是開發一種基于DNA甲基化的檢測方法用于HCC早期篩查。先前表觀基因組關聯研究識別出的大量基因使得難以在基于人群的大規模研究中篩選最有希望的候選標志物。meTSPYL5已被納入先前的多靶標組合中并顯示出有希望的結果。然而，多靶標組合和基于β值的算法面臨著獲取足夠cfDNA體積和血漿中甲基化cfDNA比例穩定性的挑戰。因此，本研究使用qMSP來確定meTSPYL5的存在與否，這種方法操作、分析簡單，成本低廉且可擴展。

泛癌分析顯示，TSPYL5在多種癌癥中高甲基化，這與先前關于TSPYL5在胃癌、結直腸癌和膠質瘤中高甲基化和低表達的報道一致。盡管meTSPYL5并非HCC特異性，但其高甲基化差異可以提高檢測的靈敏度。未來有必要進一步研究meTSPYL5在鑒別肝臟良惡性疾病中的應用價值。通過在高危人群中檢測meTSPYL5，臨床醫生可能會在HCC更早期、手術切除可行且有效的階段識別出疾病。使用該檢測方法監測HCC術后微小殘留病（minimal residual disease, MRD）的臨床價值值得進一步研究。此外，由于meTSPYL5在血漿中在所有HCC分期中均被頻繁檢測到，它也可能成為更早監測復發的一種方式。

然而，本研究仍存在一些局限性。首先，meTSPYL5檢測方法需要進一步優化以滿足III類體外診斷試劑的注冊標準。其次，樣本量有限，特別是關于肝炎和肝硬化的病理學數據不足，這降低了對檢測方法靈敏度的準確評估以及對這些癌前病變進行進一步協變量分析的能力。需要更大規模的隊列研究來驗證meTSPYL5標志物用于基于人群的HCC篩查的有效性。第三，需要進行充分和精心設計的進一步研究，以驗證其在監測MRD和復發方面的預期應用。

異常DNA甲基化在基因表達和HCC癌變中起著至關重要的作用。本研究首次通過整合WGBS和mRNA-Seq數據的分析，識別了全基因組范圍的甲基化生物標志物，并通過qMSP驗證了meTSPYL5作為HCC檢測的潛在血漿生物標志物。