細菌生物膜是由胞外聚合物(EPS)包裹形成的三維細菌群落結構，為細菌抵抗抗菌劑和免疫清除提供了屏障，使得感染治療復雜化。臨床中，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)與大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli)常被同時檢出，二者可形成混合生物膜。由于EPS成分的協同積累和信號分子的交叉調控，混合生物膜比單一物種生物膜表現出更高的穩定性和耐藥性，導致治療難度增加�？股�素的過度使用加速了細菌耐藥性的發展，而植物來源的精油因其生物相容性和強大的抗菌特性受到關注。其中，肉桂醛(cinnamaldehyde, CA)和香芹酚(carvacrol, CV)在抑制S. aureus或E. coli生物膜形成方面顯示出潛力，但存在水溶性差、揮發性強等應用挑戰。納米乳可增強疏水性抗菌劑的溶解度和穩定性，而抗菌劑的聯合應用已證明可顯著增強抗菌效果。因此，本研究旨在探究CA與CV在抑制S. aureus和E. coli混合生物膜形成方面的協同效應，并制備相應的納米乳(CA/CV NEs)以提升其效能。

體外混合S-E菌在共孵育24小時后傾向于形成生物膜。研究表明，CA與CV的組合顯著增強了對S-E的抗菌活性(FICI = 0.3125)，其抗菌效果優于CA(256 μg/mL)或CV(256 μg/mL)單獨使用，證明了協同抗菌活性。同時，在不同質量比(CA/CV = 1:1, 2:1, 4:1, 1:2)下，抑制S-E生物膜形成的Q值在1.15 ~ 2.5之間，表明其對抑制S-E生物膜形成具有協同效應。其中，質量比為4:1時Q值最高，因此選擇此比例的組合(記為CA/CV)進行后續研究。

為克服CA/CV水溶性低、揮發性高的缺點，采用高速乳化法制備了CA/CV納米乳(CA/CV NEs)。優化后的制備工藝為：吐溫80比例為8% (v/v)，油相比例為6% (m/v)，均質速度10000 rpm，均質時間6分鐘。優化后的納米乳粒徑為43.3 ± 0.005 nm，多分散指數(PDI)為0.183 ± 0.006，zeta電位為-7.47 ± 0.39 mV。透射電鏡(TEM)圖像顯示其呈球形形態。在4°C下儲存30天后，納米乳的粒徑和外觀無明顯變化，表現出良好的穩定性。高效液相色譜(HPLC)測定顯示，CA和CV的負載效率分別為90%和97.5%，負載量分別為43.2 mg/mL和11.7 mg/mL。

與游離的CA/CV組合相比，CA/CV NEs對S-E的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)均降低至128 μg/mL。時間-生長曲線表明，在1/8 ~ 1/2 MIC (16 ~ 64 μg/mL)濃度范圍內，納米乳對S-E的生長影響輕微。CA/CV NEs以濃度依賴的方式抑制S-E混合生物膜的形成。即使在32 μg/mL (1/4 MIC)的低濃度下，也顯示出顯著的抑制效果，抑制率達到17.3%。在64 μg/mL (1/2 MIC)濃度下，結晶紫染色顯示，對照組有致密、深紫藍色染色，表明形成了厚實的生物膜；而CA/CV和CA/CV NEs則顯著降低了染色強度。定量分析顯示，CA/CV NEs組的生物膜抑制率進一步提升至40.24 ± 0.69%。掃描電鏡(SEM)觀察顯示，對照組形成了厚實的S-E混合生物膜；經CA或CV單獨處理后，生物膜變薄、瓦解，但仍可觀察到明顯的細菌聚集；而在CA/CV NEs處理組，僅觀察到輕微的細菌聚集，且殘留的金黃色葡萄球菌數量遠多于大腸桿菌。這種增強的抑制效果應歸因于納米乳增加了細菌對其的攝取。

細菌粘附是生物膜形成過程的第一階段。研究表明，CV不影響S-E的粘附，CA有輕微的抑制效果。相比之下，CA/CV和CA/CV NEs由于CA與CV的協同作用，顯著抑制了S-E的粘附。值得注意的是，CA/CV NEs組的相對抑制率達到41.83 ± 0.78%。細菌運動性有利于細菌定植，并可促進生物膜形成。LB瓊脂平板實驗結果顯示，納米乳能顯著抑制混合S-E的擴散，相對抑制率約為16%。胞間多糖黏附素(Polysaccharide intercellular adhesin, PIA)是生物膜的關鍵成分，可促進細菌粘附。剛果紅瓊脂平板實驗顯示，對照組和CV組菌落呈黑色(PIA陽性)；CA處理后菌落顏色略淺；CA/CV和CA/CV NEs組菌落顏色比CA組更淺。定量分析PIA含量顯示，CA/CV NEs組(40 ± 0.81 μg/mL)的PIA濃度顯著低于對照組(55 ± 0.82 μg/mL)和CA/CV組(46 ± 0.82 μg/mL)。結果表明，CA/CV組合，尤其是納米乳形式，能顯著抑制S-E生物膜中PIA的合成，從而通過抑制粘附過程減少生物膜形成。

胞外蛋白是生物膜基質的主要成分。監測不同處理后胞外蛋白量的變化發現，與CA(68.85 ± 1.08 μg/mL)或CV(74.08 ± 1.42 μg/mL)單獨使用相比，CA/CV和CA/CV NEs能顯著減少胞外蛋白的分泌，濃度分別降至50.87 ± 1.60和42.06 ± 1.80 μg/mL。這表明CA/CV NEs能有效減少生物膜的胞外蛋白。自誘導劑-2 (Autoinducer-2, AI-2)群體感應系統在革蘭氏陽性和陰性細菌中普遍存在，并能顯著促進金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生物膜形成。因此，研究通過qRT-PCR檢測了CA/CV NEs對S-E混合生物膜中AI-2合成關鍵酶LuxS基因表達的影響。結果顯示，與CA或CV單獨處理組相比，CA/CV和CA/CV NEs組的LuxS表達顯著下調。這種下調導致AI-2產量減少。與基因表達結果一致，CA/CV NEs處理后AI-2含量降低了53.97 ± 1.59%，遠高于其他處理組。結果表明，CA/CV NEs可通過下調LuxS來減少AI-2的產生。

基于體外結果，通過小鼠植入物S-E感染模型評估了CA/CV NEs在體內對S-E混合生物膜形成的抑制作用。在小鼠皮下植入無菌醫用導管后注射S-E菌懸液，連續7天在感染部位皮下注射PBS、游離CA、游離CV、CA/CV混合物或CA/CV NEs。第8天取出植入物，通過平板計數法評估導管表面的細菌數量，并使用SEM觀察導管表面生物膜的形成。平板計數結果顯示，CA/CV NEs處理后，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的菌落數顯著減少。定量結果顯示，對于金黃色葡萄球菌，CA/CV和CA/CV NEs組的細菌數量分別減少了1.26 ± 0.03 log₁₀和1.75 ± 0.10 log₁₀；對于大腸桿菌，則分別減少了0.76 ± 0.23 log₁₀和1.39 ± 0.25 log₁₀。SEM觀察顯示，對照組導管表面形成了致密、厚實的生物膜，且其中金黃色葡萄球菌占多數；而在CA/CV NEs組，僅觀察到少量細菌聚集。所有結果證明，CA/CV NEs能在體內有效抑制S-E生物膜的形成。此外，細菌感染通常伴有嚴重的炎癥反應。檢測小鼠血清中的促炎因子發現，TNF-α和IL-6的含量顯著降低。周圍皮膚組織的H&E染色圖像也顯示，CA/CV NEs組的炎癥細胞浸潤顯著減少，表明炎癥得到緩解。

以蒸餾水為陽性對照、生理鹽水為陰性對照評估了CA/CV NEs的溶血活性。在治療所用濃度(128 μg/mL和64 μg/mL)下，溶血率低于5%，表明CA/CV NEs在所用劑量下具有良好的血液相容性。血液學安全性評估顯示，CA/CV NEs組小鼠的白細胞計數(WBC)、血細胞比容(HCT)和血小板計數(PLT)與對照組無顯著差異。組織病理學分析顯示，心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟等主要器官未觀察到顯著的病理變化。對藥物代謝關鍵器官肝臟和腎臟的安全性評估測試了血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和丙氨酸氨基轉移酶(ALT)。數據顯示，CA/CV NEs組小鼠的上述生化參數始終處于正常生理范圍內，表明CA/CV NEs未對小鼠肝、腎造成損傷。所有結果表明，CA/CV NEs在傷口治療期間具有良好的體內安全性。

總之，本研究構建并優化了具有協同抑制S-E混合生物膜形成的CA/CV納米乳。與游離CA/CV相比，其對混合生物膜的抑制活性顯著增強。CA/CV NEs通過抗細菌粘附、減少PIA和胞外蛋白的產生、抑制LuxS/AI-2通路來抑制混合生物膜的形成。在植入物感染模型中，CA/CV NEs能有效抑制S-E生物膜的形成，同時降低細菌負荷。本研究為利用中藥活性成分防治混合生物膜相關感染提供了新策略和新視角。