《Lab Animal》：The adrenal stress response involves distinct dynamics of both cortisol and corticosterone in the axolotl salamander
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本研究針對蠑螈應激通路在損傷與再生過程中的作用尚未明確、其主導糖皮質激素（GC）種類不明的問題，開展了墨西哥鈍口螈腎上腺應激反應的系統性研究。研究團隊通過藥理學挑戰、手動應激、離體組織培養及體內成像等技術，揭示了皮質醇和皮質酮在不同應激條件下（如手動刺激、損傷、AVT/ACTH給藥）呈現不同的釋放動力學與調控機制，提出了皮質醇可能作為其主導糖皮質激素，并部分作為兒茶酚胺系統的延伸發揮作用的新假說。該研究不僅為將應激激素測量納入廣泛的蠑螈研究提供了方法學支持，也為理解應激通路在再生生物學中的復雜角色提供了關鍵見解。
墨西哥鈍口螈是一種神奇的模式生物，以其卓越的器官和肢體再生能力而聞名于世。然而，在再生研究中，啟動再生反應的損傷信號，特別是其中可能涉及的應激通路的作用，目前仍不甚明了。這主要是因為，損傷與應激在時間上是緊密關聯的，但墨西哥鈍口螈的應激通路激活情況在很大程度上仍是未解之謎，甚至連其主導的糖皮質激素是哪種都尚未有定論。在脊椎動物中，主導的糖皮質激素因物種而異，例如皮質醇是人類和硬骨魚的主要激素，而皮質酮則在嚙齒類、鳥類和爬行類中占主導。傳統觀點認為，包括大多數蠑螈在內的兩棲動物，其應激反應以皮質酮為主。這種知識空白，無疑限制了我們全面理解再生過程及其與應激系統的相互作用。為了填補這一空白，一個國際研究團隊在《Lab Animal》上發表了一項深入研究，旨在系統地表征墨西哥鈍口螈的腎上腺應激反應，并提供測量其應激激素的方法，以推動其在發育和再生等廣泛研究領域的應用。
研究人員運用了多種體內外實驗技術來解答上述問題。關鍵的實驗方法包括：1) 藥理學挑戰實驗：對動物肌肉注射（i.m.）促腎上腺皮質激素（ACTH）或靜脈注射（i.v.）精氨酸加壓催產素（AVT），模擬經典的下丘腦-垂體-腎間（HPI）軸激活，并收集系列時間點的血漿、粘液和組織樣本，通過商業ELISA試劑盒測定激素水平。2) 生物應激模型：設計了模擬實驗操作的“手動應激”程序，以及標準的肢體截肢損傷模型，用以研究生理相關的應激反應。3) 體外組織孵育：從動物體內分離腎上腺組織，在培養基中直接加入AVT、ACTH、乙酰膽堿（ACh）或腎上腺素等潛在刺激因子，孵育后分別測定組織和培養基中的激素濃度，以探究激素合成與釋放的調控機制。4) 分子成像與生理測量：使用正電子發射斷層掃描（PET）和放射性葡萄糖類似物（18F-FDG）在體監測糖皮質激素對組織葡萄糖攝取的影響；通過超聲心動圖測量心率，并使用血糖儀監測血糖變化。5) 分子組織學分析：利用熒光雜交鏈式反應原位雜交技術，在腎上腺組織切片上檢測關鍵酶（如CYP11β1、CYP17）和受體（MCR2）的mRNA表達，以探索激素產生細胞的異質性。所有實驗動物均為1.0-2.0歲、混合性別的墨西哥鈍口螈。
研究結果
ACTH激發試驗增加了axolotl血漿中的皮質醇和皮質酮水平，其中皮質酮占主導
肌肉注射ACTH后，血漿中皮質醇和皮質酮水平均顯著升高，并在1小時后達到峰值。與注射生理鹽水的對照組相比，這種升高是ACTH特異的。重要的是，在峰值時，皮質酮的上調幅度顯著高于皮質醇，表明在ACTH激活經典HPI軸通路時，皮質酮是主導的糖皮質激素。粘液樣本中僅檢測到皮質酮的升高。此外，腎上腺組織內的兩種激素濃度也在ACTH刺激后增加，且皮質酮的增加更為顯著。
Axolotls在給予AVT時產生內源性ACTH
靜脈注射AVT后，血漿ACTH水平迅速升高，證實了AVT在axolotl中具有促ACTH釋放的作用。隨后，血漿皮質醇和皮質酮水平也相應增加。與ACTH試驗結果一致，皮質酮的增加在幅度上再次占據主導地位。這些結果表明，通過AVT激活HPI軸，同樣優先驅動皮質酮的合成與釋放。
與通過AVT或ACTH激活不同，手動應激誘發了以皮質醇為主的反應
對動物進行模擬搬運和處理的手動應激后，血漿皮質醇和皮質酮水平均升高，但峰值出現在應激后5小時。與藥理學刺激相反，在絕對水平和變化倍數上，皮質醇的升高都顯著高于皮質酮，表明在手動應激條件下，皮質醇成為了主導的釋放激素。值得注意的是，當在手動應激前使用黑色素皮質素2型受體拮抗劑抑制ACTH受體功能時，皮質酮的升高被完全阻斷，而皮質醇的升高不受影響。這提示皮質酮的釋放嚴格依賴于經典的HPI軸（ACTH-MCR2通路），而皮質醇的釋放至少部分通過不依賴ACTH的機制調控。
截肢損傷增加了皮質醇和皮質酮水平
在截肢損傷模型中，兩種激素的血漿水平再次升高。皮質酮在損傷后10分鐘即顯著升高，并在1小時達到峰值，其升高幅度（16倍）遠大于皮質醇（3.8倍）。這表明，對于損傷這種特定應激，皮質酮同樣是主導的應答激素，且其反應更為迅速。
體外腎上腺組織孵育確定了皮質醇和皮質酮合成與釋放的不同機制
離體腎上腺組織孵育實驗進一步揭示了兩種激素調控的差異。乙酰膽堿能強烈刺激皮質醇的釋放（進入培養基），但對皮質酮的合成與釋放無影響。相反，AVT和ACTH能有效刺激皮質酮的合成與釋放，但對皮質醇釋放的刺激作用弱于ACh。腎上腺素也能刺激皮質酮的合成。這些結果支持了皮質醇的釋放可能由交感神經末梢釋放的ACh直接調控的假說，而皮質酮的調控則更依賴于經典的HPI軸通路。
Axolotl腎上腺包含異質性的GC產生細胞群
通過HCR原位雜交對腎上腺組織進行分析，發現表達類固醇合成關鍵酶CYP11β1的細胞群體具有異質性。大多數細胞同時高表達皮質醇合成關鍵酶CYP17和ACTH受體MCR2。但也存在一些亞群，例如高表達CYP17但低表達或不表達MCR2的細胞，這些細胞可能代表了不依賴ACTH的皮質醇產生細胞；以及低表達或不表達CYP17但高表達MCR2的細胞，這些細胞可能主要產生皮質酮。這種細胞異質性為兩種激素的獨立調控提供了可能的解剖學基礎。
在靜脈注射皮質醇和皮質酮后，只有皮質醇降低了骨骼肌和肝臟中的葡萄糖攝取
通過PET成像監測葡萄糖類似物18F-FDG的攝取發現，靜脈注射皮質醇能顯著降低骨骼肌和肝臟對葡萄糖的攝取，這是糖皮質激素的經典生理效應之一。而注射同等劑量的皮質酮則未產生此效應。在血糖測量中，無論是注射ACTH、皮質醇還是皮質酮，都能引起血糖升高，但皮質醇的升血糖效應更為顯著。這表明，在介導某些下游生理效應（如抑制外周葡萄糖攝�。┓矫�，皮質醇比皮質酮具有更強的效力。
研究結論與意義
本研究系統性地描繪了墨西哥鈍口螈復雜且出乎意料的腎上腺應激反應圖譜。核心結論是：墨西哥鈍口螈同時利用皮質醇和皮質酮這兩種糖皮質激素，但它們在不同應激條件下占主導地位，并受到不同機制的調控。具體而言：1) 當通過經典的HPI軸通路（由AVT或ACTH激活）激活時，皮質酮是主導的激素。2) 在手動應激以及乙酰膽堿直接刺激下，皮質醇的釋放更為突出，提示存在一種涉及交感神經信號傳導的替代機制。3) 在應對截肢損傷時，兩種激素均增加，但皮質酮占主導，表現為一種損傷特異性反應。4) 在直接介導經典的糖皮質激素信號生理效應（如抑制外周組織葡萄糖攝�。⿻r，皮質醇的效力更強。
基于這些發現，研究者提出了一個新穎的假說：axolotl可能依賴皮質醇作為其主導的糖皮質激素，其功能部分上作為兒茶酚胺系統的延伸；相比之下，皮質酮則主要通過經典的下丘腦-垂體-腎間軸進行調控。 這項研究具有多重重要意義：首先，它明確了在axolotl研究中測量哪種（或兩種）糖皮質激素的困惑，為未來將應激評估納入axolotl的發育、環境、再生和轉化醫學研究提供了至關重要的方法學依據和具體建議。其次，它揭示了應激反應在再生模型中的復雜性和特異性，特別是損傷與一般性應激可能通過不同的激素動力學來影響再生過程，這為理解應激如何調控（通常是抑制）再生能力開辟了新的研究方向。最后，該研究增進了我們對脊椎動物應激內分泌學進化與多樣性的理解，挑戰了“兩棲動物以皮質酮為主導”的簡單概括，展示了即使是近緣物種，其應激系統的調控也可能存在顯著差異。
