《Journal of Extracellular Vesicles》：Development of a Live-Cell Imaging Assay to Elucidate Spatiotemporal Dynamics of Extracellular Vesicle Fusion with Target Cells
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本研究開發(fā)了名為“細胞外囊泡融合時空成像法（EV-FUSIM）”的新型活細胞成像技術(shù)，成功實現(xiàn)了對細胞外囊泡（EV）與靶細胞的結(jié)合、內(nèi)吞及膜融合過程的實時、原位可視化與定量分析。該方法利用SunTag系統(tǒng)進行信號放大，揭示了攜帶水皰性口炎病毒G糖蛋白（VSV-G）的EV的快速融合動力學(xué)，并證明融合主要發(fā)生在早期內(nèi)體中。此項技術(shù)為篩選融合性EV亞群、鑒定調(diào)控EV融合的分子靶點及優(yōu)化EV介導(dǎo)的腔內(nèi)治療性載藥提供了強大工具。
細胞間通訊是生命活動的基礎(chǔ)，細胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作為脂質(zhì)雙層包被的納米顆粒，是介導(dǎo)細胞間物質(zhì)與信息交流的關(guān)鍵載體。它們攜帶蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等功能性分子，在生理與病理過程中扮演重要角色，同時也被視為極具潛力的納米級藥物遞送載體。然而，內(nèi)化的EVs最終命運如何，特別是其能否與靶細胞膜融合并將腔內(nèi)“貨物”有效遞送至細胞質(zhì)，仍然是該領(lǐng)域亟待解決的核心科學(xué)問題。現(xiàn)有的大部分EV“貨物”遞送檢測方法依賴于功能活性讀數(shù)，是間接的，且難以從時間與空間上捕捉EV融合這一瞬時事件本身。本研究旨在填補這一技術(shù)空白，開發(fā)一種能夠直接、實時觀測EV與靶細胞相互作用的成像新方法。
為達成此目標，研究人員開發(fā)了名為“細胞外囊泡融合時空成像法（EV-FUSIM）”的創(chuàng)新技術(shù)。其核心原理基于SunTag信號放大系統(tǒng)，構(gòu)建了一個精巧的EV“信使”與細胞“探測器”體系。EV供體細胞經(jīng)過工程化改造，其釋放的EVs腔內(nèi)膜上被標記了紅色熒光蛋白mScarlet3與串聯(lián)重復(fù)的SunTag肽段。相應(yīng)的，EV受體細胞則表達綠色熒光的單鏈抗SunTag抗體（STAb-GFP）。當被標記的EVs與靶細胞結(jié)合并被內(nèi)吞后，如果發(fā)生膜融合，其腔內(nèi)的SunTag肽段便會暴露于細胞質(zhì)中，從而迅速募集并結(jié)合大量的STAb-GFP，在融合部位局部聚集形成高亮度的綠色熒光斑點，實現(xiàn)信號的高倍放大與可視化。與此同時，EVs本身的紅色熒光（mScarlet3）可用于同步追蹤其結(jié)合與內(nèi)吞過程。
研究團隊首先證實了該系統(tǒng)的可行性。他們成功構(gòu)建了可釋放腔內(nèi)SunTag標記EVs的供體細胞系（HeLa palm-mScar3-10xST），并通過蛋白S酶K保護實驗等驗證了SunTag在EVs上的腔內(nèi)正確定向。為了獲得高融合效率的模型，他們在供體細胞中共表達了病毒融合蛋白VSV-G，顯著增強了EVs的釋放量并使其具備強融合能力。將純化的、攜帶VSV-G的SunTag標記EVs添加到表達STAb-GFP的受體細胞（HeLa或A549）后，活細胞共聚焦顯微鏡成像清晰地揭示了整個動態(tài)過程：紅色熒光點（EVs）迅速在細胞表面聚集并被內(nèi)吞，而僅在VSV-G EVs處理組中，在早期時間點（約1小時內(nèi)）出現(xiàn)了顯著的綠色熒光斑點，明確指示了膜融合事件的發(fā)生。
借助精心設(shè)計的3D圖像分析流程，研究實現(xiàn)了對EV結(jié)合/內(nèi)吞與融合事件的精確定量。分析顯示，VSV-G不僅大幅提升了EVs的融合效率，也顯著增加了其與細胞的結(jié)合和內(nèi)吞。通過提高成像時間分辨率，研究者甚至捕捉到了單個EV內(nèi)吞體從紅色（僅EV）轉(zhuǎn)變?yōu)榧t綠共定位（EV融合）的實時過程，證實了該技術(shù)的高時空分辨率。重要的是，通過使用半乳糖凝集素3（Galectin-3）報告系統(tǒng)，他們排除了觀察到的現(xiàn)象是由內(nèi)體/溶酶體破裂導(dǎo)致的可能性，確證了信號來自真正的膜融合。
EV-FUSIM的強大之處在于其能夠解析調(diào)控EV生命周期的不同步驟。例如，用巴弗洛霉素A1抑制內(nèi)體酸化，或通過點突變（VSV-G P127D）破壞VSV-G的融合活性，這兩種處理都特異性阻斷了EV融合事件，而對EV的結(jié)合與內(nèi)吞過程沒有顯著影響。這凸顯了EV-FUSIM在篩選特異性影響融合步驟的分子或藥物方面的獨特價值。
此外，該技術(shù)還能揭示融合事件發(fā)生的亞細胞定位。通過將EV-FUSIM與細胞器染料（如標記質(zhì)膜/內(nèi)體的CellMask、標記酸性晚內(nèi)體/溶酶體的LysoTracker）共定位分析，研究發(fā)現(xiàn)VSV-G EVs的融合主要發(fā)生在早期、酸性較弱的非溶酶體內(nèi)體區(qū)室中，而非質(zhì)膜或晚內(nèi)體/溶酶體。這與VSV-G在弱酸性（約pH 6.2）環(huán)境下發(fā)生構(gòu)象變化觸發(fā)融合的特性相符。更有趣的是，相當一部分（約33.7%）融合事件發(fā)生在細胞核附近，這提示此類EVs可能將“貨物”遞送至靠近細胞核的區(qū)域，這對于需要入核發(fā)揮功能的治療性載荷（如CRISPR-Cas9系統(tǒng)）可能具有積極意義。
綜上所述，本研究成功建立的EV-FUSIM方法，是EV研究領(lǐng)域的一項重要技術(shù)進步。它首次實現(xiàn)了在活細胞中對EV結(jié)合、內(nèi)吞及膜融合全鏈條事件的同步、實時、可視化與定量分析。應(yīng)用該方法，研究不僅驗證了VSV-G可高效驅(qū)動EV融合，還詳細描繪了其快速、依賴于內(nèi)體酸化、且偏好早期內(nèi)體的融合特性。展望未來，EV-FUSIM為在更復(fù)雜的生理環(huán)境下探索EV的生物學(xué)功能提供了強大工具。它有望用于鑒定天然存在的融合性EV亞群、發(fā)現(xiàn)調(diào)控EV融合的新宿主因子、評估不同細胞狀態(tài)對EV攝取與融合的影響，并最終指導(dǎo)設(shè)計更安全、高效、靶向的EV基治療性遞送系統(tǒng)，推動基礎(chǔ)研究與臨床轉(zhuǎn)化的雙重進展。
