《Journal of Extracellular Vesicles》：Nanomotor-Driven Extracellular Vesicles With Effective Tissue Penetration for Targeted Therapy of Primary Ovarian Insufficiency
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本文綜述了干細胞來源的細胞外囊泡在治療化療誘導的早發性卵巢功能不全中所面臨的挑戰，如穩定性差、組織穿透力弱和靶向性不足。作者團隊開發了一種裝載納米馬達驅動囊泡（LEVs）的溫敏可注射水凝膠（LEVs-Gel），利用POI卵巢微環境中高表達的活性氧和一氧化氮合酶作為趨化劑，引導LEV穿透上皮層和白膜，主動靶向卵巢皮質和髓質，有效恢復卵巢內分泌與儲備功能，改善生育力。其機制涉及維持氧化-抗氧化平衡、抑制細胞凋亡和促進卵巢血管生成。該研究為POI的靶向治療提供了極具前景的新策略。
納米馬達驅動的細胞外囊泡用于治療早發性卵巢功能不全的研究
1 引言
化療藥物，特別是順鉑等，可對卵巢造成顯著損傷，導致早發性卵巢功能不全，引起不孕、圍絕經期癥狀和骨質疏松等并發癥。研究表明，卵巢損傷源于直接的DNA損傷、過量的活性氧生成和線粒體功能障礙。雖然間充質干細胞及其衍生的細胞外囊泡為POI的功能重建和生育力恢復帶來了希望，但EVs的臨床應用受到其不穩定性、組織穿透力有限以及缺乏對卵巢損傷部位的靶向遞送的限制。傳統EVs依賴被動擴散，難以有效穿透卵巢上皮層和白膜等生理屏障，到達富含卵泡的皮質或更深部的髓質。因此，迫切需要賦予EVs自主運動能力以解決上述問題。
2 結果與討論
2.1 LEVs納米馬達的合成與表征
為合成一氧化氮驅動的LEVs，研究團隊策略性地用L-精氨酸衍生物修飾EVs膜表面。通過溫和的修飾技術，將膽固醇-L-精氨酸整合到EVs的脂雙層膜中，制備出LEVs。表征結果顯示，LEVs保留了典型的杯狀形態，并表達外泌體標志物CD9、CD63、CD81和TSG101。與EVs相比，LEVs的粒徑略有增加，zeta電位更負，這歸因于L-精氨酸羧基的暴露。傅里葉變換紅外光譜和熒光共定位研究證實了CLR成功整合到EVs膜上。
2.2 LEVs納米馬達的抗氧化、自主運動與趨化特性評估
在化療誘導的POI細胞模型中，ROS和NOS水平顯著升高。給予LEVs可顯著降低ROS和NOS水平，且其抗氧化性能優于傳統EVs。在POI細胞環境中，LEVs可持續釋放NO長達48小時，這為其納米馬達特性提供了基本推進力。運動軌跡追蹤顯示，EVs表現出典型的布朗運動，而由納米馬達驅動的LEVs則展現出拋物線軌跡的自主運動，其運動速度顯著高于EVs。通過設計的Y形通道實驗證實，LEVs能夠主動向POI-KGN細胞裂解物產生的ROS/NOS梯度遷移，表現出趨化行為。此外，與EVs相比，LEVs能更快速地被POI-KGN細胞攝取，表明自主運動增強了LEVs的細胞攝取效率。
2.3 LEVs-Gel的合成與表征
研究團隊合成了殼聚糖/β-甘油磷酸鈉/明膠溫敏水凝膠作為LEVs的遞送載體。該水凝膠在25°C時為可流動的前體，在37°C時發生凝膠化。通過優化明膠濃度，最終選用0.9%明膠的水凝膠，因其具有更小的孔徑和更平緩的LEVs釋放曲線。水凝膠通過靜電相互作用吸附帶負電的LEVs，實現穩定裝載和緩釋。體外釋放動力學顯示，LEVs-Gel具有先突釋后緩釋的特點，在24天內累計釋放超過70%。生物相容性實驗表明，LEVs-Gel具有良好的細胞相容性，不影響細胞增殖和活力，并能顯著降低POI細胞模型的凋亡率。
2.4 LEVs-Gel增強EVs在POI小鼠卵巢中的滯留與組織穿透
通過卵巢內注射DiI標記的EVs、LEVs和LEVs-Gel，并利用實時成像系統追蹤，評估了它們在POI小鼠卵巢中的滯留和組織穿透能力。結果顯示，EVs組在48小時后僅保留約13%，72小時后降至5%。LEVs組的滯留時間略長，但在第7天已檢測不到。而LEVs-Gel組由于水凝膠的緩釋作用，在48和72小時的滯留量分別是LEVs組的3.3倍和4.3倍，到第21天仍有約16%的EVs保留。更重要的是，組織切片分析顯示，LEVs-Gel組有大量EVs均勻分布于卵巢皮質和髓質，熒光強度顯著高于其他組，表明LEVs-Gel不僅延長了EVs的局部滯留時間，還通過納米馬達的主動運動顯著改善了其在卵巢組織中的穿透性。相比之下，在健康小鼠卵巢中注射LEVs-Gel，EVs主要滯留在卵巢邊緣，穿透有限，這證實了POI卵巢中高水平的ROS/NOS對LEVs的趨化和驅動至關重要。
2.5 LEVs-Gel促進POI小鼠卵巢功能的恢復
治療21天后，評估了LEVs-Gel對POI小鼠卵巢功能的影響。LEVs-Gel治療有效恢復了POI小鼠的動情周期生理節律。在激素水平方面，LEVs-Gel顯著提高了血清雌二醇和抗繆勒管激素水平，并對卵泡刺激素和黃體生成素水平有改善趨勢。組織學分析表明，化療導致POI小鼠各級卵泡數量顯著減少，閉鎖卵泡增加。LEVs-Gel治療顯著增加了各級發育階段卵泡的數量，減少了閉鎖卵泡，表明其能促進原始卵泡的生長、發育和成熟，抑制卵泡閉鎖，從而恢復卵巢儲備功能。
2.6 LEVs-Gel促進POI小鼠生殖能力的恢復
研究進一步評估了LEVs-Gel對POI小鼠生殖能力的影響。體外成熟實驗顯示，LEVs-Gel處理組的卵母細胞成熟率顯著提高。體外受精結果顯示，LEVs-Gel治療顯著提高了受精率和囊胚形成率。自然交配實驗表明，LEVs-Gel治療21天后，POI小鼠的平均活產仔數顯著增加，而胎仔死亡率、子代性別比和存活率與對照組無顯著差異。對子一代小鼠的生長發育指標評估也未發現異常。體內生物安全性評估顯示，LEVs-Gel移植3個月后，小鼠主要臟器形態正常，血液生化指標無異常，表明其無明顯毒副作用。
2.7 LEVs-Gel對POI小鼠卵巢的RNA-seq分析
RNA測序分析揭示了LEVs-Gel治療的分子機制。與對照組相比，POI組下調的基因主要參與膽固醇和類固醇等關鍵生物分子的合成與代謝，以及氧化還原酶活性、過氧化物酶體功能和線粒體嵴完整性相關通路，表明化療損害了卵巢激素內分泌功能和抗氧化能力。LEVs-Gel治療后，與卵巢激素內分泌功能和抗氧化能力相關的基因表達上調。KEGG通路富集分析進一步證實，LEVs-Gel治療激活了與卵巢激素內分泌功能、抗氧化信號以及血管生成相關的通路，如HIF-1和cGMP-PKG信號通路。
2.8 LEVs-Gel恢復POI小鼠卵巢功能的分子機制
機制研究表明，LEVs-Gel通過多種途徑恢復卵巢功能。首先，它維持了卵巢內的氧化-抗氧化平衡。LEVs-Gel治療顯著降低了POI卵巢組織中ROS、iNOS和8-羥基脫氧鳥苷的水平，提高了總抗氧化能力以及谷胱甘肽過氧化物酶1和谷胱甘肽合成酶的表達。同時，也改善了卵母細胞內的氧化應激狀態和線粒體膜電位。其次，LEVs-Gel抑制了細胞凋亡。治療顯著降低了卵巢顆粒細胞中磷酸化H2AX和cleaved caspase-3的表達水平。最后，LEVs-Gel促進了卵巢血管生成。蛋白質印跡分析顯示，治療上調了MEK1/2、ERK1/2的磷酸化水平以及HIF-1α和血管內皮生長因子A的表達。免疫組化分析證實，LEVs-Gel治療顯著增加了卵巢組織中CD34陽性的微血管密度。因此，LEVs-Gel可能通過調節HIF-1α/VEGFA信號通路促進卵巢血管生成。
3 結論
綜上所述，該研究成功開發了一種裝載納米馬達驅動LEVs的可注射水凝膠用于POI治療。LEVs-Gel利用POI卵巢微環境中高水平的ROS/NOS作為趨化劑和驅動燃料，引導LEVs主動穿透卵巢屏障，靶向損傷部位。水凝膠載體延長了LEVs的局部滯留和緩釋時間。體內實驗證明，LEVs-Gel能有效恢復POI小鼠的卵巢內分泌與儲備功能，提高生育力，且安全性良好。其治療機制涉及維持氧化-抗氧化平衡、抑制細胞凋亡、減少卵母細胞氧化損傷以及通過調節HIF-1α/VEGFA通路促進卵巢血管生成。該整合療法為化療引起的POI患者提供了一種有前景的靶向治療策略。
