一種通過酶引導(dǎo)策略篩選降解三氯卡班的微生物的富有洞察力的方法：Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans的解毒調(diào)控與能量代謝
《Journal of Hazardous Materials》：Insightful approach for screening triclocarban-degrading microbes via enzyme-guided strategy: detoxification regulation and energy metabolism by
Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans
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三氯生（TCC）生物降解研究通過酶引導(dǎo)的篩選策略從5000余菌株中選出Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans (DP)，其48小時(shí)內(nèi)降解26.0% TCC并同步降解毒性中間產(chǎn)物，通過LPS修飾、外排泵及酶催化等多機(jī)制解毒，能量代謝轉(zhuǎn)向丙酸代謝和三羧酸循環(huán)，適應(yīng)營養(yǎng)限制與低濃度TCC脅迫。
李崇樹|王長來|盧啟英|張潔|嚴(yán)龍|葉金紹
中國廣東省濟(jì)南市濟(jì)南大學(xué)環(huán)境與氣候?qū)W院，廣東省廣州市510632，廣東省環(huán)境暴露與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
摘要
生物降解對于清除受污染環(huán)境中的三氯卡班（TCC）至關(guān)重要。然而，目前僅分離出少數(shù)能夠降解TCC的純培養(yǎng)菌株，且降解過程中涉及的細(xì)胞毒性和解毒機(jī)制仍不甚明了。基于富集培養(yǎng)的傳統(tǒng)篩選方法效率低下。本研究利用現(xiàn)有的功能性酶信息、生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫、微生物集合及生物信息學(xué)工具，探索了高通量篩選潛在降解TCC的功能細(xì)菌的可行性，并系統(tǒng)研究了TCC引起的細(xì)胞毒性和解毒反應(yīng)。從超過5000株候選菌株中篩選出8株代表性菌株，其中Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans（DP）在48小時(shí)內(nèi)可降解1 mg/L TCC及其水解產(chǎn)物3,4-二氯苯胺（3,4-DCA）和4-氯苯胺（4-CA）的26.0 ± 0.70%。在TCC脅迫下，DP保持了膜完整性和存活率（TCC處理組分別為7.42% ± 1.36%和94.28% ± 0.53%，而對照組分別為4.75% ± 0.28%和95.15% ± 0.97%），盡管活性氧（ROS）水平升高。TCC暴露增強(qiáng)了丙酸代謝、TCA循環(huán)和電子傳遞鏈活性，使能量分配從生物合成轉(zhuǎn)向應(yīng)激反應(yīng)和生存。DP采用了多種解毒機(jī)制，包括脂多糖（LPS）修飾、膜通透性改變、外排泵作用和酶催化。關(guān)鍵能量代謝物（如果糖-1,6-二磷酸、乙酰輔酶A和α-酮戊二酸）的濃度在TCC脅迫下降低。DP通過丙酸代謝途徑補(bǔ)充了琥珀酸和丙酮酸。本研究為篩選降解有機(jī)污染物的新細(xì)菌提供了新的視角，并揭示了TCC脅迫下代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)制。
引言
三氯卡班（TCC）是一種廣泛用于個(gè)人護(hù)理和家用產(chǎn)品中的廣譜合成抗菌劑，因其具有內(nèi)分泌干擾作用、環(huán)境持久性和生態(tài)毒性而備受關(guān)注[1]。據(jù)估計(jì)，中國每年TCC和另一種抗菌劑三氯生（triclosan）的總消耗量約為1200噸[2]。由于其親脂性和生物累積潛力，TCC可能發(fā)生長距離傳輸[3]，并在各種環(huán)境樣本、植物、動(dòng)物甚至人體樣本中被檢測到[1]。中國中部城市污水中的TCC濃度范圍為60–760 μg/L[4]。生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估表明，TCC對亞洲海洋生物的威脅比歐洲或北美更大[5]。這些負(fù)面影響凸顯了迫切需要有效的可持續(xù)修復(fù)策略來清除受污染環(huán)境中的TCC。
雖然光解可以減輕TCC的毒性，但在渾濁的廢水中效果不佳[1]。生物降解是一種更有前景且環(huán)境友好的去除方法；然而，目前分離出的降解TCC的細(xì)菌較少，包括
屬（YL-JM2C, LY-I）[6]、[7]、屬（MC22, TCC-2, TCC-1）[8]、[9]、[10]、 BX2[11]和 MC46[12]、[13]。值得注意的是，這些研究使用的TCC濃度（4–20 mg/L）遠(yuǎn)高于環(huán)境中的實(shí)際濃度。例如， TCC2在24小時(shí)內(nèi)可水解10 mg/L TCC的96.88%，但同時(shí)產(chǎn)生了有毒的3,4-DCA和4-CA[10]，這些物質(zhì)可能造成二次污染。因此，這些水解產(chǎn)物的進(jìn)一步降解往往是完全解毒的限制因素[11]，這凸顯了在實(shí)際環(huán)境基質(zhì)中實(shí)現(xiàn)高效生物降解的必要性。由于外膜的屏障作用，革蘭氏陰性細(xì)菌能夠抵御TCC的侵害。
ATCC 10536對TCC的最小抑制濃度超過5 μg/mL，且未觀察到膜損傷[14]。 PD1222無法降解TCC，在50 μg/L TCC濃度下完全抑制了反硝化作用[15]。我們之前的研究表明，盡管 ATCC 8739不能水解TCC，但在含有0.4 g/L葡萄糖的M9培養(yǎng)基中暴露于0.1 μM TCC 12小時(shí)后，會(huì)誘導(dǎo)出可逆的適應(yīng)性反應(yīng)，包括外排泵激活、細(xì)胞分化和LPS合成[16]。因此，有效的TCC降解菌可能依賴于主動(dòng)的解毒機(jī)制（如酶促降解或外排作用），而不僅僅是外膜屏障功能。值得注意的是，在無葡萄糖條件下（0.36 g/L），TCC的降解效率更高[10]，這可能是由于碳代謝產(chǎn)物的抑制作用。然而，目前尚不清楚功能細(xì)菌如何在低TCC濃度下調(diào)節(jié)能量代謝以維持解毒和細(xì)胞活性。傳統(tǒng)上，功能性微生物的篩選主要依賴于經(jīng)典培養(yǎng)方法[17]，這些方法耗時(shí)且結(jié)果不確定性較大。基于酶的篩選方法可能為解決這些問題提供新的思路。例如， TCC2中的酰胺酶TccA負(fù)責(zé)TCC的初始水解[10]， BX2中的同源蛋白TccS也具有相同功能[11]。鑒于同源蛋白在不同物種間通常具有保守的功能，我們假設(shè)TccA/TccS的同源序列可以作為分子標(biāo)記，快速從微生物數(shù)據(jù)庫和菌株集合中識別潛在的TCC降解菌株，從而克服基于培養(yǎng)方法的局限性。分子生物學(xué)和多組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，以及UniProt和NCBI等數(shù)據(jù)庫中日益豐富的微生物基因組和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，為基于同源性的高通量篩選功能微生物奠定了基礎(chǔ)。
本研究通過基于酶的生物信息學(xué)篩選方法發(fā)現(xiàn)了潛在的TCC降解菌。在候選菌株中，兼性需氧菌（DP）在M9培養(yǎng)基中48小時(shí)內(nèi)表現(xiàn)出最高的TCC降解能力，并在四種測試條件下均保持穩(wěn)定的降解性能，因此被選為進(jìn)一步研究對象。本研究旨在（1）評估基于酶的篩選方法識別功能性降解菌的可行性；（2）通過流式細(xì)胞術(shù)和轉(zhuǎn)錄組分析闡明TCC誘導(dǎo)的防御和解毒反應(yīng)；（3）通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)，揭示營養(yǎng)限制條件下支持TCC降解的能量代謝適應(yīng)性。
章節(jié)片段
挖掘潛在的TCC降解微生物
已證實(shí)酰胺酶TccA（GenBank: ANB41810.1，Text S1）負(fù)責(zé)TCC的水解[10]，[15]，我們利用它作為參考來識別可能具有TCC水解能力的同源蛋白。首先從UniProt或NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索TccA的氨基酸序列，然后使用基本局部比對工具（BLAST，v2.15.0）進(jìn)行序列比對，以搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的同源蛋白。
潛在TCC降解菌的TCC生物降解
如圖1A所示，所有8株菌株均能在M9培養(yǎng)基中48小時(shí)內(nèi)降解1 mg/L的TCC，降解效率分別為：O.sp 19.7±0.8%、DP 26.0±0.7%、SV 17.41±1.0%、SC 10.7±0.9%、PC 16.6±1.6%、PP 20.1±2.4%、RR 23.2±2.1%和RE 12.9±0.9%。O.sp和RR的降解結(jié)果與之前關(guān)于 TCC-2[10]和 BX2[11]的報(bào)告一致。這些結(jié)果驗(yàn)證了我們篩選策略的有效性。
結(jié)論
本研究驗(yàn)證了基于酶的生物信息學(xué)策略在挖掘能夠降解合成抗菌劑（如TCC）的功能細(xì)菌方面的有效性。作為選定的8株菌株之一，DP同時(shí)表現(xiàn)出對TCC及其有毒中間體的水解能力，顯示出其在TCC污染環(huán)境中的生物修復(fù)潛力。同時(shí)，1 mg/L TCC的暴露會(huì)導(dǎo)致DP中ROS的顯著積累，從而導(dǎo)致DNA損傷。
環(huán)境影響
三氯卡班（TCC）是一種新興污染物，對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康構(gòu)成潛在風(fēng)險(xiǎn)。為克服傳統(tǒng)功能性微生物篩選方法（如周期長和效率低）的局限性，本研究開發(fā)了一種高通量篩選策略來識別潛在的TCC降解微生物。
CRediT作者貢獻(xiàn)聲明
葉金紹：撰寫、審稿與編輯、資金獲取、概念構(gòu)思。嚴(yán)龍：撰寫、審稿與編輯、監(jiān)督。王長來：數(shù)據(jù)可視化、驗(yàn)證、實(shí)驗(yàn)研究。李崇樹：原始稿撰寫、數(shù)據(jù)可視化、實(shí)驗(yàn)研究。張潔：數(shù)據(jù)可視化、實(shí)驗(yàn)研究。盧啟英：軟件應(yīng)用、數(shù)據(jù)管理。
利益沖突聲明
作者聲明以下可能被視為潛在利益沖突的財(cái)務(wù)利益/個(gè)人關(guān)系：葉金紹表示得到了濟(jì)南大學(xué)的財(cái)務(wù)支持。如果還有其他作者，他們聲明沒有已知的可能影響本文工作的財(cái)務(wù)利益或個(gè)人關(guān)系。
致謝
作者感謝國家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號22576080）的財(cái)政支持。
