《Journal of Genetics and Genomics》：Optimizing linker length of base editors for precise crop breeding and gene therapy
編輯推薦：
堿基編輯通過連接酶與Cas9 nickase的短連接子（7個氨基酸）顯著減少旁路編輯，平均降低54.4%，提升作物育種和基因治療中編輯精度。
石圓圓|袁旭欣|秦朗|周芳芳|吳國川|李百濤|姚鵬程|史明燕|馬琳莎|王毅|張媛|王晨|王學燕|黃蓓|陳杰|向志明|林秋鵬|黃家英
廣東醫科大學-廣東中醫藥大學聯合生命科學學院附屬番禺中心醫院放射科，廣東省蛋白質修飾與疾病重點實驗室，粵港澳大灣區細胞命運調控與疾病聯合實驗室，中國廣東省廣州市511436
摘要
堿基編輯技術能夠在不引起DNA雙鏈斷裂（DSB）或不需要外源供體DNA模板的情況下高效地進行核苷酸轉換。然而，其較寬的編輯窗口往往會導致旁觀者編輯（即非目標位置的基因修飾），從而增加意外突變的風險。在本研究中，我們發現連接子長度顯著影響編輯窗口的大小，使用7個氨基酸組成的連接子的堿基編輯器在水稻和人類細胞系中的13個內源性基因位點上將旁觀者編輯減少了平均54.4%。我們進一步通過調整不同脫氨酶與Cas9切口酶之間的連接子長度，開發出了一種優化策略，有效減少了多種應用中的旁觀者編輯現象，包括功能研究、精準作物育種以及病原體變異的修復。我們的工作表明，縮短連接子長度可以提高堿基編輯的特異性，解決了其在農業和治療應用中的關鍵安全問題。
引言
單核苷酸變異（SNVs）對作物農藝性狀的變異（Zhao等人，2011年）和人類遺傳疾病（Hu等人，2018年）具有重要影響。與其他需要DNA雙鏈斷裂或供體模板的基因編輯技術不同，堿基編輯器（BEs）能夠高效實現單核苷酸替換（Komor等人，2016年）。先進的堿基編輯器BE4max是通過將一種進化型的胞嘧啶或腺嘌呤脫氨酶與化膿性鏈球菌 Cas9切口酶（nSpCas9）連接而成的（Koblan等人，2018年）。最初的堿基編輯器僅限于C·G到T·A和A·T到G·C的轉換（Komor等人，2016年；Gaudelli等人，2017年）。隨著技術的進步，包括對DNA修復途徑的修改以及使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）（Tong等人，2024年）、甲基嘌呤DNA糖基化酶（MPG）（Tong等人，2023a，2023b）等酶，現在可以直接編輯腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鳥嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），從而實現了所有12種類型的點突變，大大擴展了堿基編輯器的應用范圍。這些工具推動了基因功能研究（Kuscu等人，2017年；Yuan等人，2018年）、基因治療（Komor等人，2016年；Liang等人，2017年；Zeng等人，2018年）、動物模型構建（Liu等人，2018年；Wang等人，2020年；Hu等人，2025年；Zhong等人，2025年）和精準育種（Zong等人，2017年；Li等人，2018年，2021年；Huang等人，2023年）的發展，凸顯了它們在研究和生物技術中的不可或缺性。
盡管堿基編輯器在各種應用中表現出高效率，但其較寬的編輯窗口限制了精準編輯的進展（Komor等人，2016年）。編輯窗口指的是脫氨酶在單導向RNA（sgRNA）引導下能夠有效催化堿基修飾的區域，通常覆蓋幾個到十幾個堿基。當該窗口內存在多個可編輯的堿基時，脫氨酶會非選擇性地修飾所有可訪問的堿基，導致旁觀者編輯。例如，乳腺癌易感基因1/2（BRCA1/2）（Findlay等人，2018年）和β-地中海貧血基因位點HBB（Liang等人，2017年）在活性窗口附近包含多個胞嘧啶（Cs），這些“旁觀者堿基”容易發生意外編輯，從而影響堿基編輯的精準性。
在堿基編輯系統中，連接子對于將催化結構域（脫氨酶）與靶向結構域（Cas9蛋白）連接起來至關重要，以確保編輯的精準性和效率。第一代堿基編輯器由David Liu團隊開發，使用了16個氨基酸組成的XTEN連接子（Komor等人，2016年）。后續的優化版本BE4max引入了改良的核定位信號（NLS）、32個氨基酸組成的連接子以及優化的密碼子序列，提高了編輯效率（Koblan等人，2018年）。先前的研究表明，連接子長度和剛性都會影響堿基編輯的窗口和效率（Tan等人，2019年；Kuang等人，2021年；Zhao等人，2022年；Feola等人，2024年）。然而，目前我們對連接子屬性如何影響編輯機制的理解仍然有限。大多數現有編輯器依賴經驗確定的固定連接子長度，這限制了通過調整連接子長度來減輕旁觀者效應的潛力。
因此，我們系統地研究了連接子長度如何調節堿基編輯效率和編輯窗口。我們開發了一種可調節的堿基編輯系統，通過改變連接子長度來調控編輯窗口。我們發現，將連接子長度縮短至7個氨基酸可以在保持目標編輯效率的同時顯著縮小編輯窗口，從而減少旁觀者效應�；谶@些發現，我們開發出了高效且精確的堿基編輯器，適用于作物育種和基因治療。進一步驗證表明，這一策略適用于多種脫氨酶。
在水稻原生質體和再生植物中的實驗表明，該系統在多個基因位點上提高了編輯精準度，有效減少了旁觀者氨基酸變化，降低了早終止密碼子的出現，并最小化了可變剪接的干擾。此外，我們在13個測試位點上成功修復了病原體SNVs，意外編輯減少了93.0%�？傊覀冮_發的短連接子堿基編輯器在推進精準作物育種和基因治療方面具有巨大潛力。
連接子長度調節編輯窗口寬度
我們假設脫氨酶與nCas9之間的連接子長度會影響編輯窗口，進而影響堿基編輯的精準性。為了驗證這一假設，我們首先將之前鑒定出的高效胞嘧啶脫氨酶miniSdd7整合到經典的BE4max架構中，該架構使用的是32個氨基酸組成的連接子（Koblan等人，2018年；Huang等人，2023年）。然后我們修改了miniSdd7與nSpCas9之間的連接子長度，構建了七個質粒
討論
以往對堿基編輯器（如BE4max）的優化工作大多忽略了32個氨基酸連接子對旁觀者編輯的影響。雖然最近的研究表明剛性連接子可以減少此類意外編輯（Tan等人，2019年），但我們的發現表明，簡單地縮短連接子長度就能達到類似的效果，而且連接子長度對編輯精準性的影響比剛性或靈活性更為顯著（圖S1）。基于此，我們開發了一種通用策略來調節
質粒構建
對于植物和人類堿基編輯器載體，分別使用了pnCas9-PBE（Addgene#98164）和APOBEC1-BE4max（Addgene#152989）作為骨架。關鍵的脫氨酶（如miniSdd7、TadA8e）和Cas9變體（如nSpCas9-SpG、nSpCas9-SpRY）經過密碼子優化，適用于水稻或人類細胞，并通過商業途徑合成后克隆到這些骨架中。相應的sgRNA表達載體分別使用Oryza sativa OsU3和Homo sapiens hU6啟動子構建（
未引用參考文獻
Hu等人，2025a；Hu等人，2025b；Wang等人，2020a；Wang等人，2020b。
CRediT作者貢獻聲明
石圓圓和
袁旭欣：概念構思、研究設計、數據分析、驗證、撰寫——初稿。
秦朗：方法學設計、軟件開發、數據分析、可視化。
周芳芳、
陳杰、
王晨、
向志明：資源準備。
吳國川、
姚鵬程、
王毅、
張媛、
王學燕、
黃蓓：研究實施、驗證。
史明燕和
馬琳莎：數據分析、數據管理。
李百濤：方法學設計、軟件開發。
林秋鵬和
黃家英：撰寫、審稿與編輯。
數據可用性
本研究的深度測序數據（植物和人類樣本）已存入中國國家生物信息中心（CNCB）的國家基因組數據中心（NGDC）的基因組序列檔案（GSA）和GSA-Human，分別編號為CRA037428和HRA016792。
利益沖突
作者已基于本文報告的結果提交了一項專利申請。
致謝
本研究得到了
STI 2030重大項目（2023ZD04074）、
國家自然科學基金（32422050和32401250）、
國家重點研發計劃（2024YFC3408200和2024YFF1000800）、中國科學技術協會青年精英科學家資助計劃、廣東省“珠江人才計劃”
創新創業團隊項目（2023ZT10N019）、
廣西壯族自治區國家重點研發計劃（GKN AB24153006）等項目的支持。
