糖尿病腎病（Diabetic Nephropathy, DN）是全球終末期腎病（End-Stage Renal Disease, ESRD）的主要病因。足細(xì)胞是維持腎小球?yàn)V過屏障完整性的關(guān)鍵細(xì)胞，其在糖尿病高糖環(huán)境下的損傷是DN進(jìn)展的核心環(huán)節(jié)。然而，有效的上游調(diào)控因子和精準(zhǔn)靶向遞送策略仍然有限。本研究旨在探究多聚（ADP-核糖）聚合酶1（Poly (ADP-ribose) polymerase 1, PARP1）在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷中的作用，并開發(fā)靶向遞送PARP1小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）的生物仿生納米系統(tǒng)進(jìn)行治療干預(yù)。

研究首先在高糖（High Glucose, HG, 30 mM）處理的MPC5小鼠足細(xì)胞系中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。差異表達(dá)分析鑒定出59個(gè)差異表達(dá)基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。基因本體（Gene Ontology, GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析顯示，這些基因顯著富集于TGF-β信號(hào)通路、跨膜受體絲氨酸/蘇氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)等生物過程。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）網(wǎng)絡(luò)分析揭示了PARP1、Smad3和TGFB1之間存在強(qiáng)關(guān)聯(lián)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)證實(shí)，在高糖條件下，PARP1、TGFB1和Smad3的表達(dá)均顯著上調(diào)。這些結(jié)果提示，PARP1可能通過調(diào)控TGFβ/Smads信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。

為驗(yàn)證PARP1的功能，研究使用其特異性抑制劑PJ-34進(jìn)行處理。逆轉(zhuǎn)錄定量聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot, WB）分析表明，高糖顯著上調(diào)了PARP1、TGFβ1和p-Smad3的表達(dá)，而PJ-34處理可有效抑制這種上調(diào)。功能實(shí)驗(yàn)顯示，PJ-34能夠部分恢復(fù)高糖環(huán)境下受損的細(xì)胞活力，降低乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）釋放所指示的細(xì)胞毒性，并顯著減少細(xì)胞凋亡。此外，PJ-34還下調(diào)了高糖誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子（如TGF-α、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β））的分泌。在自噬方面，PJ-34增加了微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3, LC3）-II與LC3-I的比值，并降低了自噬底物p62的表達(dá)，表明其恢復(fù)了自噬流。同時(shí)，PJ-34抑制了纖維化標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（Alpha-Smooth Muscle Actin, α-SMA）和I型膠原（Collagen I）的表達(dá)。這些結(jié)果綜合表明，抑制PARP1能有效減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞毒性、炎癥、纖維化和自噬功能障礙。

研究進(jìn)一步在鏈脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）誘導(dǎo)的1型糖尿病（Type 1 Diabetes Mellitus, T1DM）小鼠模型中驗(yàn)證PJ-34的作用。與對(duì)照組相比，糖尿病小鼠表現(xiàn)出腎臟肥大、尿白蛋白/肌酐比值（Urinary Albumin-to-Creatinine Ratio, UACR）升高、腎小球硬化以及足突廣泛融合。透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscopy, TEM）顯示糖尿病小鼠腎小球基底膜（Glomerular Basement Membrane, GBM）顯著增厚，足突寬度增加。PJ-34治療顯著改善了這些病理改變，降低了腎臟重量/體重比和UACR，減輕了GBM增厚和足突融合。分子水平上，PJ-34下調(diào)了腎組織內(nèi)PARP1、TGFβ1和Smad3的蛋白表達(dá)。免疫熒光（Immunofluorescence, IF）染色顯示，PARP1與足細(xì)胞標(biāo)記物突觸足蛋白（Synaptopodin）在糖尿病小鼠腎小球中共定位，且共定位信號(hào)在PJ-34處理后減弱。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL）染色結(jié)合Synaptopodin染色進(jìn)一步證實(shí)，PJ-34顯著減少了糖尿病小鼠腎小球中凋亡的足細(xì)胞數(shù)量。這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力支持了PARP1在糖尿病腎臟損傷中的致病作用及抑制其活性的治療潛力。

為解決小分子抑制劑靶向性不足的問題，研究開發(fā)了一種新型的、靶向足細(xì)胞的siRNA遞送系統(tǒng)。該系統(tǒng)以聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA）為核心，負(fù)載PARP1 siRNA（siPARP1），形成siPARP1-NPs。隨后，從小鼠外周血中提取紅細(xì)胞膜（Red Blood Cell Membrane, RBCm），并通過脂質(zhì)插入策略將足細(xì)胞靶向配體BMS-α修飾到膜表面，形成BMS-RBCm。最后，將BMS-RBCm包覆在siPARP1-NPs表面，制備出最終的靶向納米顆粒siPARP1-NPs@RBCm-BMS-α。

對(duì)該系統(tǒng)的表征顯示：透射電子顯微鏡圖像證實(shí)了納米顆粒具有球形核殼結(jié)構(gòu)。動(dòng)態(tài)光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）分析表明其平均水合粒徑約為556.2 nm，多分散指數(shù)（Polydispersity Index, PDI）為0.19，分布均勻。Zeta電位約為-13.4 mV。熒光定量顯示其對(duì)siPARP1的包封效率高達(dá)85.6%。血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，包封的siRNA在血清中能保持結(jié)構(gòu)完整長達(dá)24小時(shí)。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)BMS-α與紅細(xì)胞膜的結(jié)合效率高達(dá)95.98%。

安全性評(píng)估顯示，siPARP1-NPs@RBCm-BMS-α在0-50 μM濃度范圍內(nèi)對(duì)MPC5足細(xì)胞無顯著毒性。靜脈注射該納米顆粒后，小鼠的血清肌酐（Serum Creatinine, SCr）和血尿素氮（Blood Urea Nitrogen, BUN）水平在24、48、72小時(shí)均無顯著變化，且心、肝、脾、肺、腎的主要器官組織學(xué)檢查未見明顯病理損傷，證明了其良好的生物相容性。

靶向能力評(píng)估是本研究的關(guān)鍵。體外實(shí)驗(yàn)中，用DiI熒光染料標(biāo)記的siPARP1-NPs@RBCm-BMS-α與MPC5細(xì)胞共孵育，共聚焦激光掃描顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）觀察顯示，其在短時(shí)間內(nèi)即可被細(xì)胞高效攝取，而未經(jīng)BMS-α修飾的對(duì)照組攝取效率很低。流式細(xì)胞術(shù)定量顯示，BMS-α修飾組的熒光陽性細(xì)胞比例顯著高于未修飾組，且該攝取可被黑皮質(zhì)素-1受體（Melanocortin-1 Receptor, MC-1R）中和抗體所阻斷，證明了其通過MC-1R介導(dǎo)的主動(dòng)靶向作用。

體內(nèi)靶向?qū)嶒?yàn)在T1DM小鼠中進(jìn)行。光聲成像（Photoacoustic Imaging, PAI）顯示，靜脈注射DiR標(biāo)記的siPARP1-NPs@RBCm-BMS-α后，腎臟區(qū)域在8小時(shí)即出現(xiàn)強(qiáng)烈信號(hào)，并持續(xù)至24小時(shí)，而未經(jīng)修飾的納米顆粒腎臟信號(hào)很弱。對(duì)腎組織切片的CLSM觀察進(jìn)一步證實(shí)，siPARP1-NPs@RBCm-BMS-α在注射后8小時(shí)即在腎小球內(nèi)富集，信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間增強(qiáng)并持續(xù)至48小時(shí)。主要器官的分布分析表明，BMS-α修飾減少了納米顆粒在肝臟和脾臟的非特異性蓄積，增強(qiáng)了其在腎臟的靶向特異性。

在功能驗(yàn)證中，將siPARP1-NPs@RBCm-BMS-α用于處理高糖環(huán)境下的MPC5細(xì)胞。結(jié)果顯示，與單純高糖組或空載體（NPs@RBCm-BMS-α）組相比，siPARP1-NPs@RBCm-BMS-α能最有效地下調(diào)PARP1、TGFβ1和Smad3的mRNA和蛋白表達(dá)。同時(shí)，它顯著提高了細(xì)胞活力，降低了LDH釋放和細(xì)胞凋亡率，并減少了TGF-α、IL-6和IL-1β的分泌。在自噬方面，它有效提升了LC3-II/I比值并降低了p62水平。此外，該處理還顯著抑制了纖維化標(biāo)志物α-SMA和Collagen I的表達(dá)。重要的是，其在所有檢測(cè)指標(biāo)上的保護(hù)效果均優(yōu)于未修飾BMS-α的siPARP1-NPs@RBCm組和游離siPARP1組，凸顯了靶向修飾在增強(qiáng)治療效果方面的優(yōu)勢(shì)。

最后，在STZ誘導(dǎo)的DN小鼠模型中評(píng)估了siPARP1-NPs@RBCm-BMS-α的治療效果。與糖尿病模型組相比，siPARP1-NPs@RBCm-BMS-α治療顯著改善了腎臟宏觀形態(tài)，降低了腎臟重量/體重比和UACR。組織學(xué)PAS染色顯示，其有效減輕了腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張和腎小球肥大。TEM分析證實(shí)，治療顯著減少了GBM厚度和足突寬度，增加了單位長度GBM上的足突數(shù)量。分子機(jī)制上，WB和免疫組化（Immunohistochemistry, IHC）顯示治療組腎組織中PARP1、TGFβ1和Smad3的表達(dá)被顯著抑制。IF染色表明，治療減少了PARP1與Synaptopodin在腎小球內(nèi)的共定位。TUNEL染色進(jìn)一步證實(shí)，治療顯著降低了腎小球內(nèi)凋亡的足細(xì)胞數(shù)量。同樣，其治療效果優(yōu)于未靶向的siPARP1-NPs@RBCm組。

本研究通過系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、分子生物學(xué)和納米技術(shù)方法，首次闡明了PARP1作為上游調(diào)控因子，通過激活TGFβ/Smads通路驅(qū)動(dòng)糖尿病腎病中足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。更為重要的是，研究成功設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了一種創(chuàng)新的生物仿生靶向遞送平臺(tái)——siPARP1-NPs@RBCm-BMS-α。該系統(tǒng)集成了紅細(xì)胞膜的免疫逃逸特性、PLGA納米顆粒的高載藥效率以及BMS-α配體的足細(xì)胞特異性靶向能力，實(shí)現(xiàn)了PARP1 siRNA的高效、精準(zhǔn)、低毒遞送，并在細(xì)胞和動(dòng)物水平上均展現(xiàn)出優(yōu)異的腎臟保護(hù)作用。這項(xiàng)工作不僅深化了對(duì)DN發(fā)病機(jī)制的理解，也為開發(fā)基于核酸藥物的腎臟疾病精準(zhǔn)治療策略提供了新的理論依據(jù)和技術(shù)平臺(tái)，具有重要的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)潛力。未來的研究可聚焦于該系統(tǒng)的長期安全性、在更復(fù)雜疾病模型中的療效，以及探索其用于遞送其他治療性核酸以干預(yù)不同腎臟疾病的可能性。