《Frontiers in Immunology》：The critical role of Atpif1 in Her2-targeted CAR-T cell therapy for solid tumor via modulation of metabolism and mtDNA-STING signal pathway
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本研究揭示了ATPIF1在HER2靶向CAR-T細(xì)胞治療實體瘤中的關(guān)鍵調(diào)控作用。通過調(diào)節(jié)線粒體代謝重塑和線粒體DNA（mtDNA）泄漏激活的STING信號通路，ATPIF1的表達(dá)水平呈現(xiàn)出獨特的雙向調(diào)節(jié)效應(yīng)：在體外，ATPIF1過表達(dá)可提升CAR-T細(xì)胞的殺傷活性和細(xì)胞因子分泌；在體內(nèi)，ATPIF1敲低反而能增強(qiáng)其在低氧腫瘤微環(huán)境中的生存、浸潤和抗腫瘤效果，這為優(yōu)化CAR-T治療實體瘤策略提供了新的代謝干預(yù)靶點。
引言
嵌合抗原受體T（CAR-T）細(xì)胞療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中已顯示出顯著的臨床療效，但將其應(yīng)用于實體腫瘤治療仍面臨巨大挑戰(zhàn)。這主要歸因于腫瘤微環(huán)境（TME）的復(fù)雜性，包括抗原異質(zhì)性、T細(xì)胞浸潤不足、衰竭以及持久性差等因素。作為細(xì)胞能量代謝的中心，線粒體在決定T細(xì)胞分化表型和功能中起著核心作用，調(diào)控線粒體代謝可塑性被認(rèn)為是增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞抗腫瘤活性的有效策略之一。
ATP合酶抑制因子1（ATPIF1，也稱為ATP5IF1）是一種進(jìn)化上高度保守的線粒體蛋白，它通過結(jié)合ATP合酶的F1結(jié)構(gòu)域，選擇性抑制ATP的合成或水解，從而在調(diào)控細(xì)胞能量代謝中扮演關(guān)鍵角色。本研究旨在探究ATPIF1在調(diào)控靶向HER2抗原的CAR-T細(xì)胞抗實體瘤療效中的作用及其潛在機(jī)制。
材料與方法
研究者構(gòu)建了HER2靶向的CAR-T細(xì)胞，并通過基因工程手段分別上調(diào)（Her2-IF1 CAR-T）和敲低（Her2-shIF1 CAR-T）其ATPIF1的表達(dá)。通過蛋白印記、流式細(xì)胞術(shù)等方法驗證了CAR和ATPIF1的表達(dá)。利用SKBR3-Luc+人乳腺癌細(xì)胞系評估CAR-T細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性、白細(xì)胞介素-2（IL-2）和干擾素-γ（IFN-γ）的分泌水平。通過Seahorse能量代謝分析儀檢測細(xì)胞的耗氧率（OCR）以評估氧化磷酸化水平。在體內(nèi)，將CAR-T細(xì)胞過繼回輸給荷瘤NCG小鼠，通過測量腫瘤體積、重量以及免疫組化染色分析其抗腫瘤效果、細(xì)胞浸潤情況。利用Western Blot、實時熒光定量PCR等技術(shù)檢測線粒體膜電位（MMP）、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放、線粒體DNA（mtDNA）泄漏及STING信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。
結(jié)果
ATPIF1過表達(dá)在體外增強(qiáng)HER2 CAR-T細(xì)胞功能，但在體內(nèi)效果相反
體外實驗表明，與親本Her2 CAR-T細(xì)胞相比，ATPIF1過表達(dá)的Her2-IF1 CAR-T細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞裂解能力，并分泌更高水平的IL-2和IFN-γ。Seahorse分析證實，Her2-IF1 CAR-T細(xì)胞的耗氧率顯著升高，表明其線粒體呼吸功能增強(qiáng)。令人意外的是，體內(nèi)實驗結(jié)果與此相反。在過表達(dá)ATPIF1的CAR-T細(xì)胞中，盡管其在小鼠外周血和脾臟中的持久性（通過GFP+細(xì)胞百分比評估）顯著優(yōu)于親本細(xì)胞，但其在抑制SKBR3移植瘤生長方面效果最差，腫瘤重量反而更大。在低氧條件（1% O2）下，Her2-IF1 CAR-T細(xì)胞的耗竭標(biāo)志物（PD-1， LAG-3， TIM-3）表達(dá)顯著升高。
ATPIF1敲低在體外削弱HER2 CAR-T細(xì)胞功能，但在體內(nèi)增強(qiáng)其抗腫瘤療效
與過表達(dá)的結(jié)果相對，ATPIF1敲低的Her2-shIF1 CAR-T細(xì)胞在體外表現(xiàn)出最慢的增殖速率、最低的腫瘤裂解活性和細(xì)胞因子分泌水平，其基礎(chǔ)呼吸和最大呼吸能力也顯著降低。然而，在荷瘤小鼠模型中，Her2-shIF1 CAR-T細(xì)胞卻展現(xiàn)出最強(qiáng)的腫瘤抑制效果，其腫瘤重量在所有治療組中最低，盡管在體外的功能表現(xiàn)最弱。這表明ATPIF1的表達(dá)對CAR-T細(xì)胞功能具有依賴于微環(huán)境的雙向調(diào)節(jié)作用。
ATPIF1通過影響線粒體功能和細(xì)胞生存適應(yīng)低氧環(huán)境
機(jī)制探索發(fā)現(xiàn)，ATPIF1過表達(dá)會增加線粒體質(zhì)量，但降低線粒體膜電位。在常氧條件下，ATPIF1敲低會增加細(xì)胞凋亡率；但在模擬腫瘤微環(huán)境的低氧條件下，ATPIF1敲低反而能顯著增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的生存率。免疫熒光分析顯示，Her2-shIF1 CAR-T細(xì)胞在實體瘤組織中的浸潤數(shù)量（CD3+細(xì)胞數(shù)/高倍視野）最多。臨床乳腺癌組織的多色免疫組化分析也證實，組織中ATPIF1的表達(dá)水平與CD3+T細(xì)胞的浸潤呈負(fù)相關(guān)，而與缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的表達(dá)呈正相關(guān)。
ATPIF1敲低通過mPTP開放和mtDNA泄漏激活STING通路
進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ATPIF1敲低會增加線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，并導(dǎo)致mtDNA（通過ND-1和D-loop水平評估）泄漏到細(xì)胞質(zhì)中。泄漏的mtDNA隨后激活了干擾素基因刺激因子（STING）信號通路，表現(xiàn)為磷酸化STING（p-STING）、VDAC蛋白表達(dá)上調(diào)，以及下游效應(yīng)分子IFI44和IFN-β的mRNA水平升高。當(dāng)使用乙錠溴（EB）耗竭CAR-T細(xì)胞的mtDNA后，不同CAR-T細(xì)胞間p-STING和VDAC的蛋白表達(dá)差異消失，證實了mtDNA泄漏是激活STING通路的上游事件。
STING通路的激活是增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞遷移和體內(nèi)療效的關(guān)鍵
體外Transwell遷移實驗表明，在低氧條件下，Her2-shIF1 CAR-T細(xì)胞的遷移能力最強(qiáng)，而使用STING特異性抑制劑H151處理后，這種增強(qiáng)的遷移被顯著抑制。體內(nèi)實驗進(jìn)一步證實，H151處理可逆轉(zhuǎn)Her2-shIF1 CAR-T細(xì)胞在荷瘤小鼠中表現(xiàn)出的優(yōu)越抗腫瘤療效，強(qiáng)調(diào)了STING信號通路在該調(diào)節(jié)過程中的核心作用。
討論
本研究系統(tǒng)闡明了ATPIF1在調(diào)控HER2靶向CAR-T細(xì)胞抗實體瘤功能中的關(guān)鍵作用及其矛盾性。在氧氣充足的體外環(huán)境中，ATPIF1過表達(dá)通過增加線粒體質(zhì)量和氧化磷酸化能力，增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞的效應(yīng)功能和持久性。然而，在實體瘤常見的低氧、營養(yǎng)匱乏的微環(huán)境中，ATPIF1的過度表達(dá)可能會因過度抑制ATP合酶而加劇線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡和耗竭，反而損害療效。
相反，適度的ATPIF1敲低在低氧環(huán)境下解除了對ATP合酶的抑制，使其能通過水解ATP來維持線粒體膜電位，從而提升了CAR-T細(xì)胞在惡劣腫瘤微環(huán)境中的生存能力。更重要的是，敲低ATPIF1誘發(fā)的mPTP開放和mtDNA泄漏，激活了STING依賴的先天性免疫通路，進(jìn)而顯著增強(qiáng)了CAR-T細(xì)胞向腫瘤組織的遷移和浸潤能力，最終轉(zhuǎn)化為更強(qiáng)的體內(nèi)抗腫瘤效果。
該研究揭示了一個重要的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)困境：在標(biāo)準(zhǔn)體外條件下（常氧、高營養(yǎng)）旨在增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞代謝和功能的工程化策略，未必能在復(fù)雜的體內(nèi)腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生預(yù)期的治療效果，有時甚至適得其反。ATPIF1及其下游的mtDNA-STING軸，為優(yōu)化CAR-T細(xì)胞治療實體瘤提供了新的代謝和免疫調(diào)節(jié)靶點。未來的CAR-T細(xì)胞設(shè)計需要更精細(xì)地考慮腫瘤微環(huán)境的影響，并開發(fā)能夠動態(tài)響應(yīng)微環(huán)境變化（如缺氧）的智能調(diào)控策略，以彌合體外性能與體內(nèi)療效之間的差距。
