《Frontiers in Immunology》：Protective antigens hidden in the bovine Clostridium vaccine
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編者按：本研究聚焦于導致牛出血壞死性腸炎的主要病原體——A型產氣莢膜梭菌。通過反向疫苗學技術，本研究篩選出高免疫原性的非毒素蛋白ESBP（胞外溶質結合蛋白）和YnjE（類硫氰酸酶結構域蛋白），與經典毒素蛋白Plc（磷脂酶C）一同進行了系統比較。研究發現，ESBP和YnjE在小鼠模型中可誘導高滴度IgG抗體和以Th2型為主的混合Th1/Th2免疫反應，其免疫保護效果（基于生存率與體重恢復）優于一種商品化多價疫苗（Vac3），與另一種（Vac2）相當。尤為重要的是，現有商品化疫苗對這兩種關鍵非毒素保護性抗原的免疫潛力挖掘不足。本研究為非毒素蛋白作為新型疫苗核心候選抗原的開發提供了重要實驗證據，并為疫苗抗原設計與優化開辟了新思路。
引言
A型產氣莢膜梭菌是一種革蘭氏陽性厭氧菌，是導致牛壞死性腸炎和皺胃炎的主要病原體，給大規模畜牧養殖造成重大經濟損失。目前，廣泛使用的多價梭菌滅活疫苗雖然安全且能提供廣泛的覆蓋保護，但其核心目標并非產氣莢膜梭菌，針對該菌的實際防控效果缺乏明確數據支持。此外，隨著養殖業“限抗”政策的全面實施，產氣莢膜梭菌相關疾病的防控面臨新挑戰。
傳統的細菌疫苗研發策略主要依賴于“以毒素蛋白為核心保護性抗原”，但在應對致病機制復雜的病原體時逐漸顯現出局限性。隨著基因組學、蛋白質組學等技術的進步，疫苗研發的重點正從傳統毒素蛋白轉向探索在病原體生命周期中起關鍵作用的非毒素蛋白。例如，利用反向疫苗學技術已成功開發出針對腦膜炎奈瑟菌B群血清型的亞單位疫苗Bexsero。
本研究的前期工作基于對15株牛源致病性產氣莢膜梭菌的全基因組分析，利用反向疫苗學方法，從核心基因編碼的蛋白質組中，篩選出兩個高度保守、表面暴露且免疫評分優異的非毒素蛋白，即胞外溶質結合蛋白（ESBP）和類硫氰酸酶結構域蛋白（YnjE）。為比較非毒素蛋白與經典毒素蛋白的免疫學差異，本研究同時納入了經典毒素蛋白磷脂酶C（Plc）。研究旨在通過抗體滴度檢測、攻毒保護試驗等多種方法，系統評估這兩種非毒素蛋白與Plc的免疫原性和體內保護效力，闡明其作為疫苗候選抗原的潛力，為產氣莢膜梭菌疫苗的研發提供新的見解和實驗證據。
材料與方法
蛋白信息
通過反向疫苗學篩選，從NCBI和UniProt數據庫中檢索到三種蛋白的序列信息：α毒素/磷脂酶C（Plc）、胞外溶質結合蛋白（ESBP）和類硫氰酸酶結構域蛋白（YnjE）。此外，在前期實驗中鑒定出一個免疫保護效力較弱的超氧化物歧化酶（SodF），其詳細結果在補充材料中提供。
表達、純化與免疫
將三種目標基因克隆到pET-32a表達載體中，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)進行誘導表達。其中ESBP以可溶性形式表達，Plc和YnjE則以包涵體形式表達。通過鎳柱親和層析、透析和超濾濃縮獲得純化蛋白。使用純化的重組蛋白，在不添加佐劑的條件下，通過腹腔注射免疫BALB/c小鼠和昆明小鼠，進行免疫和攻毒保護實驗。
動物模型與實驗設計
研究分為兩個階段。初步驗證階段使用遺傳背景均一的近交系BALB/c小鼠，以評估重組蛋白的內在免疫原性和保護效力。擴展比較階段采用遠交系昆明小鼠，以比較重組蛋白與三種商品化多價梭菌滅活疫苗（Vac1, Vac2, Vac3）的保護效力差異。攻毒采用腹腔注射產氣莢膜梭菌ATCC13124菌株的方式，監測小鼠7天內的生存率和體重變化。
檢測指標
通過間接ELISA檢測小鼠血清中針對Plc、ESBP和YnjE的特異性IgG抗體滴度。使用夾心ELISA試劑盒檢測血清中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ等細胞因子水平。通過生存率和體重恢復情況評估免疫保護率。
結果
抗原表位分析
對Plc、ESBP和YnjE三種蛋白進行B細胞和T細胞線性表位及構象表位預測分析。所有預測的T細胞表位評分均高于90，其中YnjE的YRLASVLKY表位得分最高（95.7）。在B細胞表位中，Plc的SEGNDPSVGKNV表位得分最高。三種蛋白均含有多個高評分、表面暴露的表位，顯示出良好的免疫原性潛力。
蛋白表達、純化與抗體應答
三種重組蛋白均在大腸桿菌中成功表達并純化，經SDS-PAGE和Western blot驗證正確。間接ELISA結果顯示，三種蛋白均能有效誘導小鼠產生高滴度的特異性IgG抗體。經過三次免疫后，Plc、ESBP和YnjE的最終抗體滴度分別達到1:819,200、1:1,638,400和1:1,638,400，其中非毒素蛋白ESBP和YnjE誘導的抗體滴度高于毒素蛋白Plc。
細胞免疫應答
免疫后小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的水平均顯著升高。結果表明，免疫重組蛋白可誘導以Th2型為主的混合Th1/Th2型免疫應答，這與產氣莢膜梭菌通過外毒素感染宿主并引發以Th2型為主的宿主免疫反應的特征高度一致。
免疫保護效力評估
在BALB/c小鼠攻毒模型中，Plc、ESBP和YnjE組的7天生存率分別為80%、90%和100%，免疫保護率分別為71.4%、85.7%和100%。在體重變化方面，YnjE和ESBP組的體重恢復速度快于Plc組和PBS對照組，顯示出更好的保護效果。
在昆明小鼠模型中，與商品化疫苗比較發現，ESBP和YnjE蛋白提供的保護效力（生存率85%和90%）優于Vac3（75%），與Vac2相當，但低于保護效力最佳的Vac1（100%）。基于體重恢復的評價也得出了相似結論。
商品化疫苗的抗體應答分析
值得注意的是，盡管Plc、ESBP、YnjE和SodF四種蛋白都存在于所使用的商品化滅活疫苗中，但免疫這些疫苗的小鼠血清中，針對這四種蛋白的特異性抗體滴度普遍較低（最高僅為1:16,000），遠低于單獨使用相應重組蛋白免疫所誘導的抗體滴度。這提示現有疫苗可能未能充分激發針對ESBP和YnjE這兩種關鍵非毒素蛋白的免疫潛力。
討論
表位是蛋白質免疫原性的關鍵決定因素
本研究所涉及的Plc毒素蛋白以及ESBP和YnjE非毒素蛋白均為表面暴露蛋白。與定位于細菌內部的胞質蛋白相比，表面暴露蛋白具有更高的可及性，更易被B細胞受體直接識別，因此更有可能引發強烈的免疫反應。盡管表位預測的準確性存在爭議，但通過預測并選擇富含免疫優勢表位的蛋白進行研究，仍是一種高效策略。
非毒素蛋白的免疫保護作用
本研究發現，ESBP和YnjE這兩種看似參與代謝過程而非直接與毒力相關的非毒素蛋白，卻顯示出顯著的免疫保護作用。其保護機制可能與“營養攝取-毒力增強”和“代謝樞紐-生存必需性”有關。例如，ESBP作為胞外溶質結合蛋白，可能參與鋅、鐵等必需營養元素的獲取，而這些元素是Plc毒素活性所必需的。YnjE作為類硫氰酸酶超家族成員，可能在硫酸鹽/硫代硫酸鹽代謝等基礎生存過程中扮演關鍵角色。抗體介導的中和作用可能通過干擾這些關鍵生理功能，從而嚴重破壞細菌活力，這可能是它們能作為保護性抗原的原因。
疫苗中的保護性抗原
本研究證實了ESBP和YnjE蛋白具有顯著的免疫保護潛力。然而，在商品化疫苗（特別是Vac3）中，針對這兩種蛋白的特異性抗體滴度較低，其免疫潛力未被充分挖掘。原因可能包括兩方面：第一，全菌滅活疫苗含多種抗原，抗原間的競爭會分散機體免疫資源，削弱對ESBP和YnjE的特異性免疫應答；第二，疫苗的滅活及后續制備過程可能導致ESBP和YnjE蛋白構象改變或掩蓋其關鍵抗原表位，從而降低其免疫原性。
一個有趣的觀察是，盡管Vac1和Vac3包含相似的梭菌種類，但它們在產氣莢膜梭菌的菌株類型和抗原比例上可能存在顯著差異。這種差異提示，疫苗中關鍵的、起主導作用的保護性抗原很可能存在于這些有差異的成分中，值得深入探索。
結論
ESBP和YnjE蛋白的抗原表位顯示出較高的免疫原性潛力。在小鼠攻毒試驗中，這兩種蛋白均表現出良好的免疫原性，并能有效抵抗產氣莢膜梭菌感染。值得注意的是，在鼠模型中，ESBP和YnjE展現出的保護效力可與部分商品化疫苗相媲美，但其在牛體內的實際保護效果尚需進一步體內實驗驗證。雖然ESBP和YnjE具有強大的免疫原性和突出的保護活性，但在本研究所調查的部分商品化滅活疫苗中，其免疫潛力因抗原競爭和疫苗制備相關的結構變化而未得到充分發揮。綜上所述，這些發現揭示了ESBP和YnjE作為核心候選抗原的應用潛力，并為深入研究其用于優化抗產氣莢膜梭菌疫苗配方提供了依據。
